Reconstrucción acelerada del defecto óseo de la calvaria de rata utilizando 3D

May 20, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12145 (2023) Citar este artículo

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El injerto óseo autólogo y de autocuración de los defectos de la calva puede ser un desafío. Por tanto, la fabricación de andamios para su reparación rápida y eficaz es un campo de investigación prometedor. Este artículo proporcionó un estudio comparativo sobre la capacidad de los andamios de policaprolactona (PCL) impresos en tres dimensiones (3D) y los andamios biocerámicos de hidroxiapatita (HA) y biovidrios (BG) modificados con PCL en hueso recién formado en el área del defecto de la calvaria. Los andamios de PCL impresos en 3D estudiados se fabricaron mediante modelado capa por capa por deposición fundida. Después de evaluar la adhesión celular en la superficie de los andamios, se implantaron en un modelo de defecto calvarial de rata. Las ratas se dividieron en cuatro grupos con injerto de armazón que incluía PCL, PCL/HA, PCL/BG y PCL/HA/BG y un grupo de control sin explante. La capacidad de los andamios impresos en 3D en la regeneración del hueso calvarial se investigó mediante microtomografía computarizada y análisis histológicos e inmunohistoquímicos. Por último, también se investigaron los niveles de expresión de varios genes relacionados con los huesos, así como la expresión de miR-20a y miR-17-5p como reguladores positivos y miR-125a como regulador negativo en las vías de osteogénesis. Los resultados de este estudio comparativo han demostrado que los andamios de PCL con biocerámicas HA y BG tienen una gran variedad de aplicaciones potenciales en el campo del tratamiento de defectos de calvaria.

El tipo de lesión más habitual es la fractura ósea que puede deberse a la edad, fallos metabólicos, accidentes o traumatismos1. El hueso tiene la capacidad de regenerarse y repararse a sí mismo en pequeñas lesiones2,3. Pero las fracturas óseas grandes requieren trasplante, lo que plantea un desafío clínico importante4. La regeneración ósea mediante la implantación de matriz en el área afectada es un enfoque alternativo5. Otro método adecuado para el tratamiento de fracturas óseas, osteoporosis y anomalías óseas es la ingeniería del tejido óseo, que combina materiales de ingeniería, tecnología biomédica y células madre renovables6. Los andamios diseñados afectan significativamente el transporte de masa y apoyan la proliferación, la adhesión y el crecimiento celular7. La biodegradabilidad controlada, la resistencia mecánica adecuada y la estructura de poros interconectados con el tamaño de poro y la porosidad deseados para el crecimiento celular son las características de un andamio ideal8,9. Una estructura ósea adecuada debe tener un sistema poroso interconectado con una porosidad de aproximadamente el 65 % y un tamaño de poro de aproximadamente 200 a 800 µm, para imitar la estructura porosa de un hueso natural10. Existe un gran interés en el desarrollo de métodos constructivos para elevar la funcionalidad de los andamios. La tecnología de impresión tridimensional (3D) se ha utilizado ampliamente en el campo de la ingeniería de regeneración de tejidos biomédicos, que utiliza software de diseño asistido por computadora (CAD) para construir estructuras 3D complejas11,12,13. Con el avance de la tecnología médica, los cirujanos han podido escanear los defectos del cráneo de los pacientes mediante un escáner de tomografía computarizada (TC) y preparar un modelo de andamio 3D basado en datos digitales utilizando biomateriales para ayudar a reconstruir las deformidades del cráneo14,15,16,17,18 . Una de las tecnologías de impresión 3D más comunes y rentables es la técnica de modelado por deposición fundida (FDM), que se puede utilizar para fabricar andamios inyectando biomateriales capa por capa desde una boquilla con temperatura controlada17. Un ejemplo de biomateriales es la poli-ε-caprolactona (PCL), un polímero biocompatible que ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). Pero el PCL no es adecuado para la unión y proliferación celular debido a su hidrofobicidad superficial19. Por lo tanto, el uso de este polímero puede verse limitado en la construcción de estructuras de ingeniería de tejidos. Para resolver este problema, se utilizan cerámicas bioactivas como la hidroxiapatita (HA) y los vidrios bioactivos (BG), que son similares a la fase mineral ósea, para mejorar la unión celular de las estructuras de PCL. Los andamios cerámicos bioactivos pueden dar lugar a fuertes enlaces químicos con el tejido óseo, debido a la formación de capas de huesos similares a HA20. Por tanto, las cerámicas bioactivas son los materiales más utilizados en la ingeniería de tejido óseo debido a su alto potencial de unión con el hueso y su efecto estimulante sobre la formación de nuevo hueso21. HA (Ca5(PO4)3(OH)) es un componente mineral natural del hueso y muestra excelentes propiedades de bioactividad, biocompatibilidad, bioconductividad, no toxicidad y no inflamatorias. Es muy duro pero frágil y su velocidad de degradación dentro del cuerpo es muy lenta, por eso se utiliza junto con polímeros naturales o sintéticos para fabricar andamios22. El HA es beneficioso para la formación ósea porque estimula factores de crecimiento como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP)23. BG es una de las biocerámicas más prometedoras con buena biocompatibilidad in vitro e in vivo y, después de colocarse en un fluido biológico, BG produce capas de HA bioactivas, que se unen a los tejidos biológicos y mejoran la formación de hueso. Las desventajas de BG son su baja resistencia y fragilidad24. Los microARN (miARN) son una clase de ARN monocatenario endógenos, evolutivamente conservados, de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos de longitud, que actúan como reguladores postranscripcionales al dirigirse a regiones 3' no traducidas (UTR). de ARNm objetivo para coordinar una amplia gama de procesos biológicos25. En los últimos años, la relación entre los miARN y la formación ósea ha llamado mucho la atención. Los estudios han demostrado que los miARN tienen un efecto regulador sobre la diferenciación osteoblástica y el desarrollo óseo26.

En esta investigación, utilizamos una tecnología de impresión 3D FDM y un método sencillo de modificación posterior a la fabricación para preparar andamios que pueden promover eficazmente la reparación de la calvaria en un modelo de defecto de calvaria en rata. Se utilizaron cuatro grupos de andamios, incluidos PCL, PCL/HA, PCL/BG y PCL/HA/BG, en experimentos in vivo después de garantizar la adhesión y proliferación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano (hADMSC) en la superficie de los andamios.

Las novedades de este trabajo son las siguientes:

Esta investigación ha realizado un estudio comparativo exhaustivo de la modificación de la superficie de andamios de PCL impresos en 3D utilizando biocerámicas HA y BG solas y en combinación para la reparación del hueso calvarial dañado en ratas. La tasa de formación de hueso nuevo se evaluó mediante micro tomografía computarizada, análisis histológico que incluye: rojo de alizarina, hematoxilina-eosina (H&E), tinción tricrómica de Masson y ensayos inmunohistoquímicos (IHC). Además, se evaluó la expresión de genes relacionados con los huesos a nivel de ARNm.

Se ha investigado el efecto de la nanotomografía de soportes impresos en 3D PCL, PCL/HA, PCL/BG y PCL/HA/BG en la expresión de microARN y los genes diana implicados en la regeneración del hueso calvarial de ratas.

En los siguientes experimentos informados con vertebrados vivos y los métodos utilizados, se han considerado y observado plenamente todas las directrices y regulaciones pertinentes, en particular las directrices ARRIVE27. Además, los métodos experimentales fueron aprobados por el Comité Nacional de Ética en Investigación Biomédica de Irán (IR.IAU.SRB.REC.1401.344).

PCL (Mn = 80.000) se adquirió de Sigma-Aldrich, EE. UU. HA y BG se compraron a NikCeram Razi, Irán.

Los andamios porosos de impresión 3D se fabricaron con una impresora 3D (Omid Afarinan Mohandesi Ayande, BioFabX2, Irán) y un método FDM utilizando software (Repetier Host V2.1.3, 2011_2018). Los gránulos de PCL se funden en un cilindro calefactor y dejan una boquilla con un patrón de colocación de 0/90°. Andamios circulares de cuatro capas con un diámetro de 6 mm y los mismos parámetros: boquilla de 0,5 mm de diámetro, un espesor de capa de 0,2 mm, una distancia de 0,3 mm entre las dos cuerdas, una temperatura de 110 °C y una velocidad de 2 mm/s se fabricaron para ensayos in vitro e in vivo. Para mejorar la hidrofilicidad de la superficie de los andamios impresos en 3D, el tratamiento con plasma se realizó utilizando un generador de plasma de baja frecuencia a 90 GHz, con un reactor cilíndrico de cuarzo (Diener Electronics, Nagold, Alemania). Se condujo gas oxígeno puro a la reacción a una presión de 0,4 mbar, seguido de la ignición de la descarga luminiscente durante 3 minutos. Se preparó una solución al 1% (p/v) de HA, BG y HA/BG (1% cada uno) y para una mejor dispersión de las micropartículas, las soluciones se colocaron en un baño ultrasónico durante 20 min a 37 °C. Los armazones tratados con plasma se sumergieron en soluciones de HA, BG y HA/BG para cubrir las micropartículas en la superficie de los armazones durante la noche. Luego se lavaron con agua desionizada y se secaron. Se esterilizaron cuatro grupos de andamios (PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG) mediante UV y etanol y se utilizaron para varias pruebas.

Para caracterizar la morfología de la superficie de los andamios PCL, PCL/HA, PCL/BG y PCL/HA/BG, se utilizó un microscopio electrónico de barrido por emisión de campo (FeSEM, Mira3, Tescan, República Checa) para obtener imágenes de las muestras de acuerdo con nuestro método informado anteriormente20. .

Para evaluar la capacidad de los andamios impresos en 3D en la adhesión celular, se sembraron 104 células/cm2 de hAMSC en los andamios y TCP (poliestireno de cultivo de tejidos) como control. Después de 7, 14 días de incubación, los armazones sembrados se examinaron en términos de unión celular utilizando FeSEM (FEI ESEM Quanta 200) de acuerdo con nuestro método informado anteriormente20.

En este estudio se utilizaron ratas wistar macho de 10 semanas de edad que pesaban entre 250 y 300 g de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Teherán (Comité de Ética). Las ratas se mantuvieron en condiciones ambientales adecuadas en cuanto a luz, temperatura y nutrición.

Después de la cirugía de ratas (ver Información de respaldo 1), los andamios impresos en 3D se implantaron en el área de la calvaria. Se investigaron cuatro grupos: (1) ratas con el defecto óseo sin implantación (control) (2) ratas con el defecto óseo relleno con armazones de PCL (3) ratas con el defecto óseo relleno con armazones de PCL/HA (4) ratas con el defecto óseo relleno con armazones de PCL/BG (5) ratas con el defecto óseo relleno con armazón de PCL/HA/BG. Cada grupo fue anestesiado (con una inyección intraperitoneal de 5 mg/kg de xilazina y 100 mg/kg de ketamina) 30 días después de la cirugía y se les cortó la cabeza con una guillotina con una hoja afilada y se separaron las partes trasplantadas. Las muestras para el análisis histológico involucraron IHC, H&E, tricrómico de Masson, tinción con rojo de alizarina y micro tomografía computarizada se colocaron en formalina al 10% y para evaluar la expresión de genes y microARN involucrados en la diferenciación ósea mediante PCR en tiempo real se colocaron en -70 °C. congelador (Fig. 1e – j).

(a) La macroscopía de la morfología del andamio de PCL y las nanbiocerámicas en la superficie. (b) La morfología de la superficie de PCL/HA, (c) La morfología de la superficie de PCL/BG y (d) La morfología de la superficie de los andamios de PCL/HA/BG a 100 aumentos KX. (e) – (h) Etapas de creación de una lesión en la calvaria de rata e implantación. (i) Reconstrucción del defecto de la calvaria en el grupo de control después de 30 días. (j) Reconstrucción del defecto de la calvaria en grupos con injerto de armazón impreso en 3D después de 30 días.

Las muestras de tejido se incluyeron primero en parafina y luego se desparafinaron para teñirlas (consulte la Información de respaldo 1).

La tinción H&E es una tinción histológica común que hace que el núcleo celular se vuelva azul, la queratina, las fibras elásticas y la fibrina se vuelvan de color rojo brillante. Los portaobjetos se pusieron en hematoxilina (H9627-Sigma) durante 7 s, y después del lavado se pusieron en Li2CO3 (1.05680-Sigma) durante 2 s y luego 3 min en eosina (HT110116-Sigma). Para la deshidratación, las muestras se colocaron en etanol al 90% y al 100% durante 4 s cada uno. Al finalizar para aclarar los tejidos, se colocaron en xilol y se observaron con microscopio óptico.

Los portaobjetos desparafinados se colocan en alizarina (1.06278-Merck) durante 1 min. Para eliminar el exceso de colores, los portaobjetos se colocaron en solución de acetona/xilol (1:1), después de estar en acetona al 100%, y luego se observaron con microscopio óptico.

Primero, los portaobjetos se deshidrataron con grados decrecientes de etanol. Luego se colocaron en solución de Boen en un autoclave a 56 °C durante una hora y luego se lavaron. A continuación, se vertió tinte vagante de hematoxilina sobre el tejido durante 10 minutos. Luego, las muestras se lavaron nuevamente y se colocaron en una solución de fucsina ácida escarlata de Biebrich durante 10 minutos. Después de 10 minutos de lavado, se vertió sobre los portaobjetos una solución de ácido fosfotúngstico-fosfomolíbdico. Finalmente se colocaron en solución de azul de anilina durante 20 min. Después de lavar con agua, los portaobjetos se pusieron en ácido acético al 1% (1.00056-Merck), y después de deshidratarlos y usar xilol, se observaron.

Los portaobjetos se colocaron en una solución TBS 1X (T5912-Sigma) dentro del horno microondas hasta el punto de ebullición, luego se lavaron con PBS. Se usó Triton (T8787-Sigma) al 0,3% durante 30 minutos para permeabilizar las células. Los portaobjetos se lavaron con PBS y luego se añadió suero de cabra (G9023-Sigma) al 10% a las muestras durante 45 minutos. Se añadió anticuerpo primario (SC-365797, SC-33645) (1:100 con PBS) a las muestras y se refrigeró durante 24 h. Las muestras se lavaron varias veces con PBS, mientras que se añadió anticuerpo secundario (ORB688924) a las muestras (1:150) y se colocaron en una incubadora oscura a 37 °C durante una hora y media. Finalmente, después de lavar los portaobjetos, se añadió colorante DAPI (D9542—Sigma) en una habitación oscura y después de 20 min, las muestras se lavaron y observaron con un microscopio fluorescente (Olympus).

En este estudio, utilizamos un escáner micro-CT de rayos X in vivo (LOTUS inVi-vo, Behin Negareh Co., Teherán, Irán) en el Centro Preclínico Central (TPCF) con sede en la Universidad de Ciencias Médicas de Teherán. LOTUS-in Vivo tiene una fuente de rayos X de microenfoque de haz cónico y un detector de panel plano. Para obtener la mejor calidad de imagen posible, el voltaje del tubo de rayos X y su corriente se establecieron en 50 kV y 150 μA, respectivamente, y el tiempo de exposición del cuadro se estableció en 2 s con un nivel de aumento de 1,4. La duración total de la exploración fue de 49 min. Los espesores de corte de las imágenes reconstruidas se establecieron en 47 µm. Todo el proceso de configuración del protocolo fue controlado por el software LOTUS-in Vivo-ACQ. Los datos 3D adquiridos se reconstruyeron utilizando LOTUS inVivo-REC mediante un algoritmo estándar de Feldkamp, ​​Davis, Kress (FDK). Para el análisis de las imágenes se utilizaron los software ImageJ y Avizo28,29.

Para calcular el volumen de regeneración ósea para las muestras, la región de interés (ROI) se filtró mediante un filtro mediano (3 × 3) para eliminar el ruido y se aplicó una mejora del contraste para mejorar la apariencia visual de las imágenes. Luego, las imágenes se segmentaron mediante algoritmos de segmentación en:

Un material para el grupo de control; regeneración ósea que representaba con blanco.

Cuatro materiales para grupos de tratamiento; regeneración ósea, andamio, nanopartículas y polímero, cada uno representado con gris oscuro, blanco, gris claro y gris respectivamente.

Tres materiales para grupo de polímeros; regeneración ósea, andamio y polímero, cada uno representado con gris oscuro, blanco y gris claro respectivamente.

Finalmente, se calculó la relación entre el volumen de regeneración ósea y el volumen total (%).

En este experimento, se calculó el volumen de regeneración ósea en los grupos de control, PCL, PCL/HA y PCL/BG.

Evaluación de genes específicos de huesos de rata, incluidos ALP, BMPR2, osteocalcina, Runx2, COL1, Smad7 (inhibidor) a nivel de ARNm y varios microARN implicados en la diferenciación ósea, incluidos miR-20a, miR-125a, miR-17-5p utilizando Se realizó PCR en tiempo real. Esta técnica requiere tres pasos: 1. Extracción de ARN 2. Síntesis de ADNc 3. Técnica qPCR.

Paso 1: extracción de ARN En primer lugar, las muestras se homogeneizaron manualmente en un matraz de porcelana. Para obtener el lisado celular, se añadió Trizol (1 ml) (Kiazist, Irán) a los microtubos de las muestras, luego se vertieron 200 ml de cloroformo (DRM. CHEM, Irán) sobre las muestras y se agitaron manualmente durante aproximadamente 20 s. Después de incubar durante 15 min a temperatura ambiente, se centrifugaron durante 15 min a 4 °C y 12.000 RPM (Hettich, Alemania). La fase clara en la parte superior del microtubo que contenía ARN se transfirió a otro microtubo. En los microtubos que contenían la fase superior (que contenía ARN), se agregaron 500 ml de isopropanol (DRM. CHEM, Irán) y se agitaron varias veces para mezclar el contenido. Luego los microtubos se colocaron en un congelador a -20 °C durante un corto período de 5 a 10 min. Para precipitar el ARN, las muestras se centrifugaron durante 10 min a 4 °C y 12.000 RPM. Se drenó la solución sobrenadante y se lavó el sedimento y se agitó con 200 ml de etanol. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 7500 RPM y 4 °C. Finalmente, se descargó el sobrenadante y se colocó el microtubo boca abajo sobre una toalla de papel durante 15 min para evaporar el alcohol. Para disolver el sedimento de ARN, se agregaron a los microtubos 20 ml de DEPC o agua libre de RNasa (Thermo, EE. UU.). Luego, el ARN extraído se almacenó en un congelador a -80 °C.

Paso 2: Síntesis de ADNc Después de descongelar el ARN extraído, se colocaron en hielo y se agitaron durante un tiempo. Para hacer ADNc, mezcle 5 µl de mezcla RT (incluido el tampón RT, la enzima RT, el cebador hexámero aleatorio), 1 µl de cebador oligodt y 1 µl de agua DEPC y mezcle 1 µl de ARN a este volumen de 9 µl en microtubos ( 0,2 ml) (Easy cDNA Synthesis Kit, Irán). Se colocaron en el termociclador (KIAGENE, Irán) según el siguiente programa de temperatura (Tabla 1).

Paso 3: técnica qPCR Primero, sacamos todos los materiales necesarios para la PCR en tiempo real del congelador y, después de agitarlos, los pusimos en hielo. Luego, de acuerdo con la Tabla 2, preparamos una mezcla de diferentes componentes de PCR para cada gen, y después de mezclar, se vertieron 9 μl en cada microtubo y se agregó 1 μl de ADNc a cada vial (el volumen final de cada vial es 10 µl). Después de mezclar y agitar, los microtubos preparados que contienen la reacción de PCR se colocaron en el dispositivo (termociclador de PCR en tiempo real, ABI Stepone, EE. UU.) de acuerdo con el programa ejecutivo de la Tabla 3. Al final, los datos que incluyen los números de CT (ciclo de umbral) ), la curva de fusión de cada gen está lista para su análisis. La expresión relativa de genes y microARN se calculó utilizando 2−ΔΔCT. Las secuencias de los cebadores se presentan en la Tabla 4 y se utilizó U6 como control interno.

En este experimento, se seleccionaron 30 ratas y se dividieron en cinco grupos: cuatro grupos con implantación de andamio y un grupo sin implantación (n = 6). Los resultados fueron analizados con el software GraphPad. Se seleccionó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparar los resultados. Se consideró un valor de P <0,05 como nivel de significación. En todos los gráficos, las letras a, b, cyd se utilizan para mostrar diferencias significativas entre los grupos.

Los métodos experimentales fueron aprobados por el Comité Nacional de Ética en Investigación Biomédica de Irán (IR.IAU.SRB.REC.1401.344).

Después del tratamiento de los andamios con nanopartículas, para garantizar un recubrimiento adecuado de la superficie de los andamios con biocerámicas, las morfologías de la superficie de los andamios PCL/HA, PCL/BG y PCL/HA/BG se caracterizaron mediante FeSEM. Como se ve en las micrografías (Fig. 1b-d), con gran aumento, se pueden ver partículas biocerámicas en la superficie de los andamios y la superficie de los andamios está bien cubierta por nanopartículas. Además, en la figura 1a se muestra la macroscopía de la estructura de PCL. Además, la investigación del efecto de la superficie de los andamios sobre la adhesión y distribución celular se realizó mediante la siembra de hAMSC en andamios PCL, PCL/HA, PCL/BG y PCL/HA/BG en los días 7 y 14. Las imágenes FeSEM mostraron que el Los andamios de PCL impresos y los andamios modificados con las nanopartículas podrían servir como sustratos adecuados para la unión de hAMSC (Fig. 2a, b).

(a) Imágenes FeSEM de hADSC cultivadas en los armazones PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG en los días 7. (b) Imágenes FeSEM que representan hADSC cultivadas en PCL, PCL/HA, PCL/BG, Andamios PCL/HA/BG los días 14.

Se realizó el análisis histológico de los defectos de la calvaria con y sin los armazones implantados durante el período de un mes después de la cirugía y los resultados se brindan en las siguientes subsecciones.

Se observa nueva formación de hueso en todos los grupos, pero las ratas a las que se les implantaron andamios, especialmente los andamios de PCL/nanobiocerámica, mostraron una mejor osificación. Los grupos PCL/HA/BG muestran los mejores resultados en cuanto a formación de hueso nuevo, seguidos de los grupos PCL/BG y PCL/HA, sin mostrar una diferencia significativa en este aspecto. En las muestras teñidas con H&E también se realizó el recuento de osteoblastos y osteocitos. Desde el punto de vista del número de estas células, no hubo diferencias significativas entre los dos grupos de control y PCL, pero los tres grupos PCL/HA/BG, PCL/HA y PCL/BG tenían más células de osteocitos y osteoblastos, y en este sentido, mostraron una diferencia significativa con el grupo de control. El mayor número de células óseas se contó en el grupo PCL/HA/BG (Fig. 3a,d).

Los andamios PCL/HA/BG impresos en 3D aceleraron la regeneración del defecto óseo calvarial de rata. (a) Aspecto microscópico de la sección de tejido después de la tinción con H&E 30 días después de la operación. (b) Diagrama de formación de hueso nuevo, (c) recuento de osteoblastos (d): recuento de osteocitos en los grupos PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG.

Se realizó tinción con rojo de alizarina para observar la cantidad de mineralización del tejido formado en un momento determinado. Las áreas de formación de hueso nuevo se evaluaron utilizando el software Image J. Como se muestra en la Fig. 4a, b, la mayor cantidad de mineralización estuvo relacionada con la estructura PCL/HA/BG, por lo que hay una diferencia significativa incluso con los dos grupos PCL/HA y PCL/BG. Los andamios recubiertos con nanopartículas mostraron una diferencia significativa en comparación con el grupo PCL y el grupo de control en términos de formación de hueso, mientras que no se observaron diferencias significativas entre los grupos de control y PCL.

(a) Aspecto microscópico de la sección de tejido después de la tinción con rojo de alizarina 30 días después de la operación. (b) Diagrama de tinción con rojo de alizarina de la sección de tejido 30 días después de la implantación en los grupos PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG.

Para evaluar la regeneración ósea, también se realizó la tinción tricrómica de Masson (Fig. 5a, b), para mostrar el depósito de colágeno y hueso recién formado dentro de las construcciones implantadas un mes después de la implantación. Los datos de la tinción con tricrómico de Masson revelaron además que el grupo PCL/HA/BG mostró la mejor integración ósea y el aumento de regiones óseas nuevas en los grupos PCL/HA y PCL/BG en comparación con el grupo control y PCL. Las imágenes obtenidas de la tinción de las muestras se analizaron en términos de clasificación de la reparación ósea con base en el trabajo de investigación de Maliki Gerji30. Los datos mostraron que el hueso maduro se produjo sólo en el grupo PCL/HA/BG en una pequeña cantidad y la formación de hueso inmaduro tuvo lugar en los grupos PCL/BG y PCL/HA.

Regeneración ósea evaluada mediante tinción tricrómica de Masson. (a) Se realizó tinción tricrómica de Masson para mostrar el depósito de colágeno y el hueso recién formado dentro de la región implantada 30 días después de la cirugía. (b) Diagrama de tinción con tricrómico de Masson en los grupos PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG.

La osteocalcina y la osteonectina son marcadores de los tejidos óseos. Para investigar el nivel de regeneración del hueso calvarial en diferentes grupos de ratas, se analizó la expresión específica de dos proteínas, la osteocalcina y la osteonectina, mediante el método IHC. Como se muestra en la Fig. 6a, b, la mayor cantidad de proteínas osteocalcina y osteonectina se observó en los grupos PCL/HA/BG. Los grupos PCL/HA y PCL/BG ocuparon el segundo lugar en términos de presencia de dos de estas proteínas. La cantidad de osteonectina y osteocalcina fue muy baja en las ratas que tenían daño en el área de la calvaria sin implantación.

Estanqueación inmunohistoquímica de la sección de tejido implantado 30 días después de la operación en los grupos PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG. (a) La cantidad de proteína osteocalcina en la sección de tejido implantado. (b) La cantidad de proteína osteonectina en la sección de tejido implantado.

Las imágenes obtenidas de la micro-CT mostraron que la mejor regeneración del hueso calvarial tuvo lugar en las ratas que recibieron el andamio de PCL con nanopartículas de HA. Las ratas a las que se les implantaron los armazones de PCL/BG también tuvieron cierta reparación ósea, pero las ratas de control y las ratas que recibieron el armazón de PCL sin nanopartículas tuvieron un desempeño muy deficiente en términos de regeneración del hueso calvarial. Las imágenes 2D-μCT y 3D-μCT analizadas también se muestran en la Fig. 7a, b.

Las imágenes analizadas de 2D-μCT y 3D-μCT de la regeneración del hueso calvarial tuvieron lugar en las ratas que recibieron los armazones PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG y el grupo de control sin implantación. (a) Imágenes 3D-μCT, (b) 2D-μCT (se utilizaron los software ImageJ y Avizo para analizar las figuras).

Se calculó la relación entre el volumen de regeneración ósea y el volumen total en el grupo PCL/HA en comparación con el grupo control. La tasa de regeneración ósea en ratas que recibieron armazones de PCL/HA fue del 2,5297 %, mientras que en ratas con el defecto óseo sin implantación (control) fue del 0,2517 % significa más de 10 veces la regeneración. Además, esta relación en los grupos PCL y PCL/BG fue de 0,1057 y 0,1480 respectivamente.

Para evaluar el nivel de expresión de los marcadores de osteoblastos a nivel de ARNm, se realizó una PCR en tiempo real. Se midió la expresión relativa de los genes ALP, Col1, Osteocalcina, BMPR2 y Runx2 para investigar la diferenciación ósea y la regeneración ósea de la calvaria. La expresión más alta de los genes ALP, Col1 y osteocalcina se observó en los grupos PCL/HA/BG, por lo que la expresión de estos genes en los grupos PCL/HA/BG fue significativamente diferente en comparación con los grupos PCL, PCL/HA, PCL/ Grupos BG y el grupo control. Cabe señalar que esta diferencia se observó menos en la expresión del gen COL1. Además, el nivel de expresión de BMPR2 en los grupos PCL/HA/BG fue significativamente mayor que en otros grupos. El análisis de la expresión del gen Runx2 en los cuatro grupos probados y el grupo control mostró que el grupo PCL/HA/BG mostró una diferencia significativa con los otros grupos, el grupo PCL/BG también mostró una diferencia con los grupos PCL y control, mientras que esta diferencia también se observó en menor medida con el grupo PCL/HA. El gen Smad7 tiene un papel antagonista e inhibidor en la señalización de TGFβ/BMP. En este estudio, la expresión más baja de smad7 se determinó en PCL / biocerámica y mostró una diferencia significativa con el control (Fig. 8a-f).

Evaluación de la expresión relativa de genes específicos de hueso de rata a nivel de ARNm y expresión de microARN en la región de tejido implantado en los grupos PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG después de 30 días después de la operación. (a) ALP, (b) COL1, (c) Osteocalcina, (d) BMPR2, (e) Runx2, (f) Smad7, (g) miR-20a, (h) miR-17-5p, (i) miR -125a.

La Figura 8g-i mostró que hay diferentes expresiones de miR-20a, miR-17-5p y miR-125a en los cuatro grupos con los andamios impresos en 3D implantados entre sí, así como para controlar sin implantación. Se observó claramente una tendencia creciente de expresión de miR-20a como regulador positivo en las ratas que recibieron PCL/HA/BG en comparación con los grupos de control y PCL, incluso con los grupos PCL/HA 30 días después de la operación. Aunque no hubo diferencia significativa en la expresión de miR-17-5p en los grupos experimentales. MiR-125a, como regulador negativo, se reguló negativamente en la vía de la osteogénesis. Los grupos PCL/HA/BG mostraron la expresión más baja de miR-125a en comparación con otros grupos.

La calvaria tiene una estructura delgada y esférica. Los injertos óseos autólogos y alogénicos no pueden regenerar eficazmente defectos de calvaria de gran tamaño. Clínicamente, los defectos de la calvaria necesitan una estructura adecuada para su reparación31. Para resolver estos problemas se han desarrollado ampliamente materiales metálicos, inorgánicos y poliméricos32,33. Teniendo en cuenta que el defecto de la calvaria de los pacientes tiene una forma personalizada, la tecnología de procesamiento de impresión 3D aporta una nueva dirección para la preparación de estructuras personalizadas de defectos de la calvaria basadas en datos de TC del paciente34. FDM es una de las técnicas de impresión 3D más populares, adecuada para fabricar andamios de polímero que utilizan calor. El material utilizado en esta técnica es polímero o una combinación de polímero y cerámica. En este método, el material deseado se funde mediante calor, se exprime por la boquilla y se deposita capa por capa y se crea un andamio. La temperatura del proceso depende de la temperatura de fusión de su material estructural35. PCL es uno de los polímeros más estudiados y se ha demostrado que apoya las células óseas. PCL presenta poca estimulación inflamatoria e inmunológica; debido a su biocompatibilidad, la FDA ha aprobado el uso de PCL.

La bioactividad ósea y la afinidad celular de los polímeros sintéticos son débiles y se han informado algunos problemas de degradación, problemas mecánicos y ambiente celular ácido. En el caso de PCL, agregar BG como fase cerámica puede compensar su naturaleza hidrofóbica inherente y su mala adhesión celular, y también mejorar sus propiedades mecánicas36. Mediante la modificación de la superficie de estructuras poliméricas con biocerámicas como HA, BG, fosfato tricálcico (TCP) y silicato de calcio (CS) como biomateriales a base de calcio, fosfato y silicato, este compuesto afecta las células y mejora la osteogénesis37. Existe mucha evidencia de que la topografía afecta la diferenciación de las células madre38,39,40. Por ejemplo, en nuestro estudio anterior, mostramos el efecto de la modificación de la superficie de estructuras poliméricas con biocerámicas en la diferenciación ósea de células madre20. Pero el efecto de la topografía sobre la regeneración ósea in vivo es menos claro. En este estudio, se evaluó el potencial de los andamios fabricados impresos en 3D sin y con modificaciones posteriores a la fabricación en la formación de hueso nuevo utilizando un modelo de defecto óseo en la calvaria en ratas. Antes de los experimentos in vivo, el potencial de los andamios PCL, PCL/HA, PCL/BG y PCL/HA/BG en la unión celular se evaluó utilizando hAMSC en los días 7 y 14 después de la siembra celular mediante FeSEM. El análisis SEM reveló que los cuatro grupos de andamios sirvieron como una superficie excelente para la unión celular. Las células se expandieron en los andamios para formar una capa celular y las células recién proliferantes se comunicaron entre sí, que se vertieron en los poros del andamio. En los armazones de PCL-biocerámica, se observó la interacción entre el polímero, las nanopartículas y las células y el alargamiento celular en las nanopartículas fue significativo. En el andamio biocerámico de PCL, la rugosidad de la superficie y la propiedad de hidrofilicidad de HA y BG mejoraron la unión celular.

Para experimentos in vivo, después de asegurarse de que las ratas estuvieran inconscientes, se eliminó el cuero cabelludo en el área de la calvaria de la rata y justo en el centro de la calvaria, se eliminó de la calvaria de la rata un área con el diámetro de los andamios fabricados (6 mm). hueso y los andamios impresos en 3D implantados en el sitio del daño de Calvaria41,42. Después de 30 días, cinco grupos de ratas que incluían: control (sin implantación), PCL, PCL/HA, PCL/BG, PCL/HA/BG, fueron anestesiados nuevamente y se les cortó la cabeza y se separó la parte trasplantada de las ratas. cabezas. Las muestras para el análisis histológico involucraron IHC, H&E, tricrómico de Masson, tinción con rojo de alizarina y micro tomografía computarizada se colocaron en formalina al 10% y para evaluar la expresión de genes y microARN involucrados en la diferenciación ósea mediante PCR en tiempo real se colocaron en -70 °C. .

Los resultados de H&E mostraron que las ratas con implantación de andamios en el área lesionada tenían una diferencia significativa en comparación con el grupo de control sin implantación de andamios en términos de formación de hueso nuevo y mejor reparación. Sin embargo, el mejor grupo fue el PCL/HA/BG. El recuento de células de osteoblastos y osteocitos reveló que no había diferencias significativas entre los grupos de control y PCL, pero los grupos PCL/HA/BG, PCL/HA y PCL/BG tenían una mayor cantidad de células de osteocitos y osteoblastos. El mayor número de células óseas se contó en el grupo PCL/HA/BG. Se utilizó la tinción tricrómica de Masson para demostrar la formación de hueso nuevo y la deposición de colágeno en las construcciones implantadas. Los datos mostraron que el hueso maduro sólo se mostró en una pequeña cantidad en el grupo PCL/HA/BG y la formación de hueso inmaduro tuvo lugar en los grupos PCL/BG y PCL/HA. Se realizó tinción con rojo de alizarina para evaluar el grado de mineralización de la parte dañada de la calvaria y se compararon los resultados con la tinción tricrómica de Masson y H&E. El análisis de los resultados mostró una buena tasa de mineralización en los andamios de PCL/HA/BG implantados en el área de lesión de la calvaria, por lo que este grupo tiene una diferencia significativa en términos de tasa de mineralización con los grupos PCl/HA y PCL/BG. Los grupos PCL y control mostraron la cantidad más baja y no hubo diferencias significativas entre los dos. En general, los andamios de PCL recubiertos con biocerámica mostraron mejores resultados en esta prueba en comparación con el grupo de control e incluso con PCL solo. De hecho, la presencia de biocerámicas HA y BG mejoró la regeneración ósea. Para investigar la cantidad de reparación del hueso calvarial en diferentes grupos de ratas analizadas, se investigó mediante IHC la expresión específica de dos proteínas, la osteocalcina y la osteonectina, como marcadores de los tejidos óseos. Las mayores cantidades de proteínas osteocalcina y osteonectina se observaron en el grupo PCL/HA/BG. Los grupos PCL/HA y PCL/BG estaban en la segunda fila en términos de presencia de proteínas, y el grupo PCL sin nanopartículas biocerámicas estaba en la tercera fila. La cantidad de osteonectina y osteocalcina fue muy baja en ratas que tenían un defecto en el área de la calvaria sin implantación de andamio. Por lo tanto, la presencia de partículas biocerámicas en el andamio de impresión 3D PCL ha aumentado la expresión de osteocalcina y osteonectina, como demostraron Yong Sang Cho y su grupo en 2019 que la expresión de osteonectina y colágeno tipo I en el andamio de impresión 3D PCL era menor que Andamio compuesto PCL/HA43. Las imágenes obtenidas de la micro tomografía computarizada confirmaron los análisis histológicos y mostraron que la mejor regeneración del hueso calvarial ocurrió en las ratas que recibieron el andamio PCL/HA/BG. Las ratas con los armazones PCL/HA y PCL/BG también tuvieron cierta reparación ósea, pero el control y las ratas que recibieron el armazón PCL sin recubrimiento de nanopartículas tuvieron un desempeño muy deficiente en términos de regeneración ósea de la calvaria. Se calculó la relación entre el volumen de regeneración ósea y el volumen total en el grupo PCL/HA en comparación con el grupo control. La tasa de regeneración ósea en el grupo PCL/HA fue del 2,5297 %, mientras que en las ratas del grupo de control fue del 0,2517 % significa más de 10 veces la regeneración. Xing et al.44 demostraron el efecto topográfico de los armazones de PCL impresos en 3D para aumentar la proliferación y la diferenciación osteogénica de las células madre derivadas de la orina para la regeneración ósea. Para ello, prepararon soportes de PCL con una superficie nanotopográfica de partículas de PCL y los compararon con soportes de PCL solos in vitro. Además, investigaron el efecto de estos andamios en la regeneración del hueso del cráneo de rata. Sus resultados, basados ​​en las pruebas de tinción tricrómica de H&E y Masson y en la micro tomografía computarizada, revelaron que cuando la superficie del armazón del PCL se modificaba con partículas de policaprolactona solubles, el cráneo se reparaba mejor44. Xu et al.45 evaluaron el efecto del andamio de PCL impreso en 3D solo y también con laponita (LAP) en la regeneración del hueso calvarial de rata. Doce semanas después del trasplante, este grupo investigó la tasa de formación de hueso nuevo en el área del defecto calvarial en ratas mediante el uso de imágenes de micro tomografía computarizada y análisis histológicos como H&E, tricrómico y tinción con rojo de alizarina. Los datos y las imágenes de micro-CT mostraron que la tasa de formación de hueso nuevo era mayor en ratas que recibieron injertos de armazón de PCL/LAP que en ratas que recibieron injertos de armazón de PCL45. El efecto de los armazones compuestos de alcohol polivinílico/β-fosfato tricálcico/icariina en la reparación rápida y eficaz de defectos de la calvaria investigados por Xu et al.46. Al igual que en este estudio, este grupo creó una lesión circular en la región media del hueso parietal de la calvaria. Las imágenes de micro tomografía computarizada y los análisis histológicos de H&E y la tinción tricrómica de Masson mostraron que las ratas con defecto sin andamio no tuvieron una reparación significativa incluso hasta la semana 12, pero en las ratas con implantación de andamio, huesos nuevos habían llenado algunos de los agujeros en el andamio46. Además, la expresión relativa de los genes ALP, Col1, osteocalcina, BMPR2, Runx2 y smad7 se midió mediante el método de PCR en tiempo real para investigar la diferenciación ósea y la regeneración ósea de la calvaria. La mejor expresión de los genes óseos ALP, Col1 y osteocalcina se observó en el grupo PCL/HA/BG, por lo que la expresión de estos genes en el grupo PCL/HA/BG fue significativamente diferente en comparación con PCL, PCL/HA, PCL/BG y el grupo de control. . El análisis de la expresión del gen Runx2 en los cuatro grupos y el control reveló que el grupo PCL/HA/BG de tres componentes tenía una diferencia significativa con otros grupos y el grupo PCL/BG también mostró una diferencia significativa con los grupos PCL y control, mientras que este La diferencia se observó en menor medida con el grupo PCL/HA. Runx2 es un factor de transcripción implicado en la formación ósea que activa el promotor de genes específicos de los huesos como ALP y COL1 durante las primeras etapas de la diferenciación ósea. Por lo tanto, es razonable que el andamio PCL/HA/BG estimule la mineralización de la matriz extracelular sintetizando COL1 para formar la matriz para la formación de osteoides, lo que se atribuye al aumento del nivel de Runx2 por HA y BG en el andamio PCL/HA/BG. . Al final, se examinó mediante qPCR el efecto de la nanotopografía de los andamios impresos en 3D sobre la expresión de microARN (miR-20a, miR-17-5p, miR-125a) involucrados en la señalización de BMP. La diferenciación osteogénica es un proceso complejo que está regulado por una variedad de factores, incluidos los microARN. Los estudios de Zhang et al. en 2011 demostró que la expresión de miR-20a endógeno aumenta durante la diferenciación ósea, y la expresión de los marcadores y reguladores óseos BMP2, BMP4, Runx2, OSX, OCN y OPN aumentó al mismo tiempo, mientras que la expresión de los marcadores de adipocitos PPARy y Los antagonistas de osteoblastos Bambi, Crim1 están disminuidos. Demostraron que miR-20a promueve la diferenciación osteogénica mediante la regulación positiva de la señalización de BMP/Runx2 al silenciar PPARy, Bambi y Crim147,48. En esta investigación, el nivel más alto de expresión de miR-20a se observó en las ratas que recibieron los andamios PCL/HA/BG, y el nivel más alto de expresión de los genes Runx2, OCN que participan en la señalización de BMP/Runx2 también se observó en estos grupos. . Smad7 tiene un papel inhibidor en la señalización de TGF β/BMP y está regulado por varios miR. miR-17-5p se dirige directamente a Smad7 en las MSC y promueve la diferenciación osteoblástica y la proliferación celular26. En este estudio, no hubo diferencias significativas en la expresión de miR-17-5p en los grupos experimentales, pero los grupos con recubrimiento biocerámico mostraron poca expresión de smad7 como inhibidor. Algunas investigaciones determinaron que miR-125a regula negativamente la diferenciación osteoblástica de hAMSC al apuntar a smad449,50. Por lo tanto, esperábamos ver una regulación negativa de miR-125a en los grupos PCL/HA/BG en comparación con el control según otros resultados obtenidos. Según el diagrama, se mostró la regulación negativa de miR-125a en los grupos PCL/HA/BG en comparación con el control.

La tinción histológica mostró que los armazones PCL/HA/BG han tenido más éxito en la regeneración ósea de la calvaria de ratas. Las biocerámicas HA y BG tienen propiedades osteoconductoras y osteoinductivas que conducen a la osteointegración entre el hueso huésped y el implante. Las señales topográficas son reconocidas por sensores celulares como las integrinas, que dan como resultado cascadas de señalización bioquímica y cambian la expresión de genes y proteínas. A las ratas se les implantaron andamios de PCL/HA/BG, las nanopartículas de HA/BG estimularon la vía de señalización de BMP. La señalización de BMP tiene un papel fundamental en la regulación de la inducción, el mantenimiento y la reparación ósea. En la topografía del andamio PCL/HA/BG, se observaron los niveles de expresión más altos de miR20a y miR17-5p (como reguladores positivos en la osteogénesis), lo que resultó en un aumento de marcadores óseos, incluidos ALP, Col 1, osteocalcina, BMPR2, RunX2, al inhibir Crim 1, Bambi, PPARY como inhibidores de la osteogénesis. Además, el andamio PCL/HA/BG había reducido más la expresión del nivel de miR-125a como regulador negativo de la osteogénesis. Por lo tanto, la presencia de biocerámicas HA y BG en ratas que recibieron implantes de PCL/HA/BG mejoró las BMP y la ALP y dio como resultado una mejora de la señalización de BMP y una mayor regeneración del área del defecto (Fig. 9).

Diagrama esquemático de la interacción de miR-20a, miR-125a y miR-17-5p en vías de diferenciación osteogénica.

Los resultados del análisis in vivo revelaron que los defectos graves de la calvaria requieren el uso de un andamio adecuado. El andamio PCL/HA/BG es un andamio adecuado para la ingeniería de tejido óseo y se recomienda para aplicaciones clínicas.

Clínicamente, los defectos de la calvaria necesitan un andamio adecuado para regenerar lesiones de gran tamaño. La tecnología de impresión 3D aporta una nueva dirección para la preparación de estructuras personalizadas de defectos de la calvaria basadas en datos de TC del paciente. Los andamios de PCL porosos se fabricaron mediante impresión FDM-3D. La modificación posterior a la fabricación de los andamios se realizó utilizando biocerámicas HA, BG y HA/BG. Primero, se investigó in vitro el potencial de los andamios en la unión de hAMSC. Luego, se evaluó la capacidad de los andamios fabricados en la reconstrucción y la formación de hueso nuevo utilizando un modelo de defecto óseo de la calvaria de rata. Los resultados del análisis histológico e IHC, la micro tomografía computarizada y la evaluación de la expresión de genes y microARN involucrados en la regeneración ósea indicaron que en el andamio PCL/HA/BG, la interacción de HA y BG causó una mejor regeneración ósea del calvario y podría ser un adecuado para Aplicaciones en ingeniería de tejido óseo.

El conjunto de datos utilizado para el análisis de este artículo está disponible previa solicitud del autor correspondiente.

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Departamento de Biología, Rama de Ciencia e Investigación, Universidad Islámica de Azad, Teherán, Irán

Nasrin Fazeli y Shiva Irani

Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Teherán, Teherán, Irán

Ehsan Arefian

Centro de Investigación de Células Madre Urogenitales, Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti, Teherán, Irán

Abdolreza Ardeshirylajimi

Departamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias, Universidad de Teherán, POBox: 141556455, Teherán, Irán

Ehsan Seyed Jafari

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NF hizo los experimentos y escribió el artículo bajo mi supervisión (ES) y EA supervisó los microARN. AA supervisó aspectos de ingeniería de tejidos. SI supervisó las secciones moleculares. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Ehsan Seyedjafari.

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Fazeli, N., Arefian, E., Irani, S. et al. Reconstrucción acelerada del defecto óseo de la calvaria de rata utilizando andamios impresos en 3D recubiertos con hidroxiapatita/biovidrio. Representante científico 13, 12145 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38146-1

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Recibido: 07 de febrero de 2023

Aceptado: 04 de julio de 2023

Publicado: 27 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38146-1

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