Muestra de microfantasma de dispersión 3D para evaluar la precisión cuantitativa en técnicas de microscopía de fase tomográfica

May 30, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 19586 (2022) Citar este artículo

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En este artículo presentamos una estructura de dispersión biomimética estructuralmente compleja, fabricada con polimerización de dos fotones, y utilizamos este objeto para comparar un sistema de imágenes computacionales. El fantasma permite adaptar la dispersión modificando sus grados de libertad, es decir, el contraste del índice de refracción y las dimensiones de la capa de dispersión, e incorpora una prueba de calidad de imágenes en 3D, que representa una sola célula dentro del tejido. Si bien la muestra se puede utilizar con múltiples técnicas de microscopía 3D, demostramos el impacto de la dispersión en tres métodos de reconstrucción de microscopía de fase tomográfica (TPM). Uno de estos métodos supone que la muestra tiene una dispersión débil, mientras que los otros dos tienen en cuenta la dispersión múltiple. El estudio se realiza en dos longitudes de onda (visible e infrarrojo cercano), que sirven como factor de escala para el fenómeno de dispersión. Descubrimos que cambiar la longitud de onda de visible a infrarrojo cercano afecta la aplicabilidad de los métodos de reconstrucción de TPM. Como resultado de la dispersión reducida en la región del infrarrojo cercano, las técnicas orientadas a la dispersión múltiple funcionan peor que un método destinado a muestras de dispersión débil. Esto implica la necesidad de seleccionar el enfoque adecuado dependiendo de las características de dispersión de la muestra, incluso en caso de cambios sutiles en la interacción objeto-luz.

Uno de los desafíos modernos en óptica computacional es obtener imágenes de muestras dispersas con alta resolución1. Esto puede atribuirse al hecho de que las estructuras biológicas complejas, como los esferoides u organoides, tienden a ser modelos más relevantes que los cultivos celulares 2D, por ejemplo, para el descubrimiento de fármacos2. Además, la mayoría de las técnicas de obtención de imágenes in vivo requieren que la luz de sonda pase a través de la compleja estructura de un tejido, lo que limita en gran medida la profundidad de la obtención de imágenes debido a la dispersión múltiple. Esta demanda estimula el desarrollo de nuevos métodos1,3,4,5, sin embargo, es difícil seleccionar uno apropiado en función de la fuerza de dispersión de la muestra analizada. Por este motivo, es esencial contar con un método versátil, repetible y cuantitativo para la evaluación de diferentes sistemas y algoritmos de imágenes para determinar sus límites de aplicabilidad en función de las propiedades de dispersión del objeto. Una posibilidad es utilizar microfantasmas calibrados como objetivos de imágenes. Desafortunadamente, los microfantasmas existentes suelen tener una dispersión débil (por ejemplo, microesferas con índice coincidente) o demasiado simplistas (por ejemplo, microesferas con índice no coincidente)6,7 en comparación con los tipos de muestras multicelulares de dispersión heterogénea para las que están destinados los métodos de dispersión múltiple. Esta es una limitación crítica al caracterizar métodos de imágenes computacionales que utilizan solucionadores no convexos, donde la convergencia iterativa depende de la complejidad del panorama energético y se asocia directamente con la complejidad 3D de una muestra8.

En este trabajo presentamos un microfantasma impreso en 3D con distribución de índice de refracción (RI) de dispersión múltiple. Para ello, aprovechamos los avances recientes en la impresión 3D mediante escritura láser directa9,10,11,12. Entre las múltiples técnicas de impresión 3D disponibles13,14,15,16,17,18, elegimos una polimerización de dos fotones que permite la impresión 3D de muestras de microfantasmas con geometría conocida y RI calibrado. En comparación con otras implementaciones de escritura láser directa, permite (1) controlar el RI con un rango de modulación relativamente alto, (2) ajustar el contraste del RI o la fuerza de dispersión después de la fabricación usando diferentes líquidos de inmersión y (3) manejar y Mida el microfantasma del mismo modo que las muestras biológicas. A continuación, presentamos la aplicación del fantasma en el campo de la microscopía de fase tomográfica (TPM), una técnica que ha demostrado impresionantes resultados de imágenes biológicas en trabajos anteriores. Sin embargo, es importante señalar que todos los métodos de imágenes computacionales pueden evaluarse con el procedimiento propuesto.

TPM es un método de obtención de imágenes cuantitativo y sin etiquetas que utiliza proyecciones ópticas a través de una muestra semitransparente a lo largo de varios ángulos de iluminación para reconstruir el RI 3D de la muestra. Este método ha encontrado varias aplicaciones en imágenes biológicas, donde la RI está directamente relacionada con la distribución de masa seca a nivel celular y subcelular. Se sabe que el índice de refracción y la masa seca son factores cruciales en el análisis de la etapa actual del ciclo celular19, la estructura celular20,21, los efectos fotobioquímicos en las células22, la influencia de factores externos en los parámetros celulares23,24 y muchos otros. Dada la gran cantidad de información proporcionada por la masa seca a nivel unicelular, existe una demanda significativa para ampliar la capacidad de analizar la masa seca a grandes grupos multicelulares, cortes gruesos de tejido o microorganismos completos. Sin embargo, para reconstruir RI 3D, los métodos tradicionales de TPM utilizan supuestos críticos en sus metodologías de reconstrucción computacional que se basan en que la muestra tiene una dispersión débil25. Estos supuestos limitan las muestras a tener espesores del orden de sólo decenas de micrones. Para muestras gruesas y complejas, se deben utilizar marcos de reconstrucción que se adapten a la dispersión múltiple. Con este fin, en los últimos años se han propuesto numerosos enfoques de TPM que introducen nuevos marcos para dar cabida a la dispersión múltiple26,27,28,29,30,31. En particular, estos enfoques utilizan solucionadores no lineales y no convexos para resolver de forma iterativa el RI 3D de una muestra. Aunque estos métodos han demostrado resultados impresionantes en la reconstrucción de RI en muestras de dispersión múltiple, su precisión cuantitativa aún no se ha caracterizado experimentalmente de manera sólida y los resultados presentados generalmente no permiten la comparación de diferentes métodos para seleccionar el enfoque adecuado para un nivel de dispersión determinado. en una muestra. La estrategia general para evaluar experimentalmente la precisión cuantitativa en los métodos TPM es reconstruir RI 3D en muestras con distribuciones RI conocidas6,7,32. No se puede esperar que un método TPM de dispersión múltiple que genere reconstrucciones RI 3D precisas de un microfantoma demasiado simplista o de dispersión débil genere reconstrucciones RI igualmente precisas para muestras de dispersión múltiple más complejas, donde la probabilidad de converger a mínimos locales es drásticamente mayor. Para caracterizar de manera sólida la precisión cuantitativa de los métodos TPM de dispersión múltiple, es imperativo utilizar microfantasmas con RI 3D conocido que imiten la complejidad estructural de los tipos de muestras que los métodos TPM deben representar. Hasta donde sabemos, estos tipos de microfantasmas de dispersión múltiple estándar no existen.

En esta sección presentamos el diseño del microfantasma impreso en 3D y su aplicación en la evaluación de tres métodos de reconstrucción TPM.

El microfantasma de dispersión que diseñamos e imprimimos en 3D consiste en un objetivo similar a una célula con estructuras de prueba internas33 incrustadas dentro de una distribución pseudoaleatoria de varillas que cambian su orientación a través de varias capas (Fig. 1a). El ancho y alto de cada varilla es igual a 0,5 \(\upmu\)m y 1,8 \(\upmu\)m respectivamente. La distancia lateral entre las varillas en cada capa se aleatoriza entre 0,7 \(\upmu\)m y 3 \(\upmu\)m y las capas se apilan verticalmente cada 1,4 \(\upmu\)m. La estructura resultante es transparente (más del 99% de transmitancia para el coeficiente de extinción de 0,1 mm\(^{-1}\)34) y dispersión múltiple35. La región de dispersión final es un cubo de 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\)m \(\times\) 40 \(\upmu\)m con un factor de relleno de aproximadamente 25% (fracción de volumen ocupada por el polímero).

( a ) Vista de media sección del diseño del microfantasma de dispersión. (b) Imagen SEM de una capa de dispersión hecha de varillas distribuidas casi al azar. (c) Varilla individual que comprende una capa de dispersión. (d) Visualización de la distribución RI 3D del objetivo de la imagen: fantasma celular. Las características subcelulares, como los objetivos de resolución (que se muestran en el recuadro) y los nucléolos celulares, están encerrados en un elipsoide truncado con dimensiones externas de 30 \(\upmu\)m \(\times\) 25 \(\upmu\)m \ (\times\) 12 \(\upmu\)m, que luego está incrustado en el centro de los 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\)m \(\times\ ) Cubo de dispersión de 40 \(\upmu\)m.

El objetivo similar a una célula incrustado dentro de las capas de varillas distribuidas aleatoriamente imita una única célula biológica encerrada dentro de un volumen de dispersión, que representa, por ejemplo, tejido. El objetivo celular se compone de subestructuras que permiten la evaluación de la precisión cuantitativa en los sistemas de imágenes TPM36. La información sobre el procedimiento de impresión 3D se proporciona en la Sección. “Fabricación de microfantasmas de dispersión 3D”. Las características principales dentro del objetivo celular incluyen objetivos de prueba de resolución, nucléolos suspendidos en un núcleo y una región de variación lenta de RI (ver Fig. 1d). En particular, el objetivo de la prueba de resolución se compone de líneas con una frecuencia espacial creciente37 hasta 1667 lp/mm. Al evaluar la frecuencia espacial máxima de las líneas que se pueden distinguir dentro del objetivo de la prueba celular, la resolución de imágenes de un método TPM de elección se puede caracterizar y potencialmente comparar con diferentes métodos de evaluación de la resolución descritos por otros grupos de investigación38,39. La distribución pseudoaleatoria de los bastones que componen la porción de dispersión del microfantoma completo se suprime dentro de 0,5 \(\upmu\)m del objetivo celular y no se cruzan con ninguna de las estructuras de prueba. Un modelo del fantasma está disponible en el conjunto de datos 140.

Se implementaron y evaluaron tres métodos de reconstrucción TPM mediante la comparación de reconstrucciones tomográficas del microfantasma propuesto. Los métodos son: (1) Gerchberg-Paopulis con restricción de soporte (GPSC)41, (2) propagación de haz de múltiples cortes con mediciones de campo eléctrico (MSBP-E)42 y (3) propagación de haz de múltiples cortes con intensidad -solo mediciones (MSBP-I)31. Para realizar la comparación, el fantasma se midió con el dispositivo TPM y se compusieron dos conjuntos de datos a partir de mediciones de campo dispersos de valores complejos del microfantasma iluminado en diferentes ángulos, utilizando longitudes de onda de 633 nm y 835 nm. Para GPSC y MSBP-E, estos conjuntos de datos se utilizaron directamente. Para MSBP-I, sólo se utilizaron los componentes de amplitud. Las mediciones y sus correspondientes reconstrucciones 3D RI están disponibles en el conjunto de datos 140.

La Figura 2 muestra los resultados de la reconstrucción para ambas longitudes de onda. Caracterizamos la resolución lateral (xey) de las reconstrucciones de TPM visualizando las líneas de prueba de resolución dentro del microfantasma. Para comparar cuantitativamente los tres métodos de reconstrucción de TPM, se generaron gráficos de sección transversal horizontal y vertical a través de estas pruebas de resolución calculando el promedio y la desviación estándar de los valores de píxeles en las filas o columnas adyacentes a las líneas blancas discontinuas aa y bb, por \(\pm 4\) píxeles. Estos gráficos de sección transversal se muestran a continuación.

Comparación de reconstrucciones tomográficas del microfantasma medidas con longitud de onda de 633 nm y 835 nm y calculadas con 3 algoritmos. Las regiones coloreadas sombreadas que rodean cada uno de los gráficos 1D en la parte inferior representan la desviación estándar.

La geometría compleja conocida y la distribución RI del microfantasma desarrollado permiten demostrar que cambiar la longitud de onda del visible al infrarrojo cercano afecta la aplicabilidad de los métodos de reconstrucción TPM43,44. Las vistas ampliadas de la región de prueba de resolución después de reconstruir el microfantasma usando el algoritmo GPSC con luz de longitud de onda de 633 nm revela artefactos granulados significativos que ocluyen las características de la línea dentro de la región de prueba del microfantasma. Observamos que estos artefactos disminuyen considerablemente cuando se reconstruyen con luz de longitud de onda de 835 nm. Esto sugiere que, a una longitud de onda de 633 nm, el microfantasma tiene una dispersión demasiado alta para que sea aplicable el GPSC. La disminución de los artefactos de reconstrucción GPSC para 835 nm coincide con el conocimiento convencional de que las longitudes de onda de luz más largas son más resistentes a la dispersión que las longitudes de onda más cortas. Para confirmar que esta observación se debe a una dispersión reducida y no a características de ruido diferentes entre las dos fuentes de luz, analizamos la desviación estándar del ruido de fase en una región libre de objetos dentro de los conjuntos de datos de entrada. Para la luz de longitud de onda de 633 nm, se observó una desviación estándar del ruido de fase de \(\sigma = 0,10\) radianes, mientras que para la luz de longitud de onda de 835 nm, se observó una desviación estándar del ruido de fase de \(\sigma = 0,08\) radianes . Dada una variación tan pequeña entre estas características de ruido, llegamos a la conclusión de que el factor principal en la calidad de la reconstrucción del GPSC que afecta su capacidad para visualizar las líneas de prueba del microfantasma es la fuerza de dispersión del microfantasma en las dos longitudes de onda diferentes.

En particular, tanto MSBP-E como MSBP-I utilizan la regularización de variación total (TV) para estabilizar la convergencia del solucionador iterativo no convexo en presencia de ruido45. Especialmente en el caso de utilizar luz de longitud de onda de 633 nm, la regularización de TV da como resultado reconstrucciones RI 3D con menos ruido en comparación con las reconstrucciones 3D calculadas mediante GPSC, que no utiliza regularización de TV. Esto se puede visualizar directamente en las secciones transversales 2D de la Fig. 2 y se confirma mediante los límites de la desviación estándar que se muestran en los gráficos de la sección transversal 1D. Sin embargo, el inconveniente de la regularización es que tiene un efecto borroso en las funciones de alta resolución. Debido a que el microfantasma se dispersa menos en la luz de longitud de onda de 835 nm, solo GPSC logró reconstruir las líneas de prueba de alta frecuencia espacial dentro del microfantasma. Normalmente, la fuerza de la regularización de TV se ajusta manualmente para adaptarse a los factores experimentales y equilibrar el equilibrio entre lograr una estabilidad iterativa frente a una alta resolución de imagen.

En términos del RI promedio, el conocimiento sobre la distribución RI real del fantasma hace posible comparar cuantitativamente los resultados de la reconstrucción con GPSC, MSBP-E y MSBP-I. Vemos que todos los métodos capturan con éxito las características generales del microfantasma. Como se describió anteriormente, la reconstrucción 3D mediante GPSC exhibe artefactos granulados cuando se usa luz de longitud de onda de 633 nm, probablemente debido a que el microfantasma tiene dispersión múltiple en esa longitud de onda. Además, MSBP-I produce valores de RI ligeramente sobreestimados y también sufre artefactos espaciales de baja frecuencia (que se han observado en otras técnicas de imágenes de fase de intensidad únicamente46,47). Otros trabajos han demostrado que MSBP-I demuestra una mayor precisión cuando se utiliza iluminación parcialmente coherente, lo que reduce drásticamente el ruido coherente31. El trabajo futuro puede incluir la repetición de este análisis en una gama más amplia de técnicas de reconstrucción de TPM con microfantasmas de dispersión más complejos.

Con los resultados presentados mostramos que cambiar la longitud de onda de la iluminación afecta la naturaleza de dispersión del microfantasma. Específicamente, aunque el microfantasma tiene una dispersión múltiple con luz de longitud de onda de 633 nm, tiene una dispersión débil con luz de longitud de onda de 835 nm. Naturalmente, esto indica que la elección óptima para la longitud de onda de iluminación debe equilibrar la resolución (\(\frac{\lambda }{NA}\) para una sola proyección) y la fuerza de dispersión. Como se ha demostrado, hay casos en los que, en lugar de aplicar métodos de dispersión múltiple, resulta ventajoso aumentar la longitud de onda de la iluminación (disminuyendo así la fuerza de dispersión de la muestra) y aplicar un método basado en el teorema de difracción de Fourier que no utiliza el restricción de variación total. Sin embargo, lo más fundamental es que demostramos que los microfantasmas impresos en 3D permiten una evaluación cuantitativa de la precisión de la reconstrucción de RI en 3D a través de varias metodologías de TPM. Esta capacidad es importante al elegir un método TPM optimizado para clases específicas de muestras y condiciones de imagen.

Los trabajos futuros se centrarán en desarrollar métodos para cuantificar la fuerza de dispersión de los fantasmas y relacionar estas cantidades con las propiedades de dispersión de diferentes tipos de tejidos. Si tiene éxito, esto nos permitiría diseñar y fabricar (utilizando los métodos presentados) estructuras de microfantasmas 3D para imitar una amplia gama de especímenes biológicos que van desde grupos multicelulares hasta tejidos voluminosos y organismos pequeños. Otra dirección posible es ajustar los parámetros de dispersión en el fantasma para caracterizar el rendimiento de las imágenes para diversas técnicas utilizadas para obtener imágenes en el tejido de dispersión, como la tomografía de coherencia óptica o la microscopía de reflectancia confocal. Finalmente, imaginamos que se puede aprovechar la flexibilidad de la polimerización de dos fotones para fabricar microfantasmas en diferentes sustratos (por ejemplo, en el extremo de la fibra óptica para tomografía de rotación de muestras), utilizando resinas biocompatibles (para combinar objetivos de prueba con células vivas). en el volumen de medición único48) o modificar la resina con partículas funcionales18 (por ejemplo, para acomodar sistemas que también miden la absorción49,50,51,52,53).

Presentamos a continuación la (1) metodología con la que imprimimos en 3D múltiples microfantasmas de dispersión; (2) el diseño óptico de los sistemas de imágenes TPM que utilizamos para recolectar experimentalmente mediciones del campo eléctrico de dispersión del microfantasma; y (3) breves descripciones teóricas de tres algoritmos tomográficos que se utilizaron para reconstruir RI 3D a partir de los datos medidos.

El fantasma se fabrica mediante litografía láser de dos fotones, en la que se escanea un rayo láser enfocado dentro de resina líquida. La resina dentro del volumen focal del láser se polimeriza localmente. El ajuste de la trayectoria de escaneo y el tiempo de exposición del rayo láser permite el control simultáneo de la geometría impresa en 3D (precisión del orden de 100 nm) y RI (precisión del orden de \(5 \times 10^{-4}\) , máximo \(\Delta\)RI = 0,03 dentro de la estructura) en tres dimensiones. Utilizamos Photonic Professional GT (Nanoscribe GmbH) equipado con un objetivo de microscopio 1,3 NA 100\(\times\) y una platina de escaneo piezoeléctrico. El fantasma se fabrica con resina IP-Dip (Nanoscribe GmbH) encima de un cubreobjetos #1.5H (configuración por inmersión54). Después de la fabricación, la estructura se desarrolló en PGMEA (acetato de monometiléter de propilenglicol; 12 min), seguido de alcohol isopropílico (10 min) y luego se secó con secador. La metodología completa para la fabricación y validación de las características se puede encontrar en nuestro trabajo anterior33.

Para realizar nuestros experimentos de imágenes TPM, el microfantasma se sumergió en aceite Zeiss Immersol 518F (RI\(_{632}\) nm = 1,5123), que proporciona un contraste RI similar al del caso de las células sumergidas en medio de cultivo. Mediante el uso de aceites de inmersión con RI variables, es posible ajustar las propiedades de dispersión de la posfabricación del microfantasma.

En este trabajo, se utilizó un sistema óptico, como se muestra en la Fig. 3a), para estudiar el fantasma de dispersión. El sistema es un microscopio TPM55 basado en Mach-Zehnder, que funciona en una configuración de ángulo limitado con muestra estacionaria e iluminación girada con un espejo galvo (Thorlabs GVS212/M)56. La investigación se realizó con dos longitudes de onda, por lo que surgieron dos versiones modificadas del microscopio tomográfico presentado. La primera versión, \(\text {TPM}_{633}\) funciona con longitud de onda \(\lambda =\) 633 nm y la segunda, \(\text {TPM}_{835}\) con \(\lambda =\) 835 nm. El haz de entrada (S en la Fig.3a) se entrega con una fibra óptica, se colima y luego se divide en objeto y brazo de referencia. En el sistema \(\text {TPM}_{633}\) la fuente de luz era un láser de rejilla de Bragg volumétrico (Necsel NovaTru Chroma 633 SLM), \(\text {S}_{633}\), que proporcionaba un único modo longitudinal y ofrece una longitud de coherencia larga. El sistema \(\text {TPM}_{835}\) utilizó una fuente de barrido (Superlum Broadsweeper BS-840-2-HP, \(\Delta \lambda\)= 800–870 nm), \(\text { S}_{835}\) fijado en \(\lambda =\) 835 nm. Debido a la diferencia en la longitud de coherencia, se colocó un módulo de retardo adicional en el haz de referencia para mediciones \(\text {TPM}_{835}\). Los cubos de división del haz en este trabajo se recubrieron entre 400 y 700 nm o entre 700 y 1100 nm, según la longitud de onda utilizada. La distancia focal de la lente tubular TL1 era \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 150 mm y \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 200 mm. respectivamente. Ambos objetivos del microscopio (MO1 y MO2) en la Fig. 3 eran 100\(\times\) NA 1.3 Objetivos semiplano-apocromáticos, corregidos al infinito. La segunda lente de tubo TL2 utilizada fue \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 200 mm o \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 300 mm. Esto proporcionó aumentos \(M_{633}=-\,48.5\) y \(M_{835}=-\,72.7\). La cámara utilizada en el sistema fue un sensor CMOS en ambos casos, con un tamaño de 3,45 \(\mu m\) píxeles (JAI BM500GE) en el caso de \(\text {CAM}_{633}\) y 5,5\(\ mu m\) tamaño de píxel (Basler acA2040-180km) en el caso de \(\text {CAM}_{835}\). La ampliación mínima, que viene impuesta por el tamaño del píxel y la longitud de onda para asegurar la grabación correcta del holograma para cada proyección57 es \(M_{633 min}=-\,44.2\) y \(M_{835 min}=-\,53.5 \), que se cumple en ambos casos. En la Fig. 3b) se presenta un holograma de muestra. Ambos sistemas se configuraron para iluminar la muestra con un escenario de escaneo circular (ver Fig. 3d) en un ángulo cenital \(\theta =47^{\circ }\) y proporcionaron 180 proyecciones espaciadas en \(\varphi =2^{\ círculo }\). En las figuras 3c y e se presenta una muestra de la fase y amplitud proporcionada por el sistema a 835 nm.

(a) Sistema de medición de TPM basado en Mach-Zehnder. S, fuente de luz; GM, sistema galvo; TL1 y TL2, lentes de tubo; MO1 y MO2; objetivo de microscopio; SPL, plano de muestra; CAM, cámara; (b) holograma adquirido con la iluminación axial de la muestra; (c) amplitud de una proyección en \(\varphi =304^{\circ }\); (d) escenario de escaneo circular utilizado en la medición. Ángulo de rotación: \(\varphi\), ángulo cenital: \(\theta =47^{\circ }\); (e) fase de la proyección.

Se utilizaron tres métodos diferentes de reconstrucción TPM para calcular el RI 3D del microfantasma para comparar. Los datos para cada método se adquirieron a través de mediciones de dispersión de múltiples ángulos capturadas como se describe en la Sección. "Sistema de medida". Proporcionamos una breve descripción de estos métodos a continuación. Se proporcionan descripciones completas de estos métodos en las referencias respectivas.

Para proporcionar un estándar de referencia para comparar con los algoritmos de reconstrucción de TPM que utilizan modelos de dispersión múltiple, primero reconstruimos el RI 3D del microfantasma utilizando un método TPM de dispersión débil. Utilizamos específicamente el algoritmo de Gerchberg-Papoulis mejorado con restricción adicional de soporte de objetos finitos (GPSC)41. Como entradas se utilizan campos eléctricos de valores complejos medidos por nuestros sistemas TPM. El procedimiento se realiza en dos pasos. Primero, se reconstruye una distribución tomográfica 3D RI inicial a partir de las mediciones del campo eléctrico con una fuerte regularización de la variación total45. Esto se realiza mediante el método de optimización Chambolle-Pock58 y se implementa con la caja de herramientas de tomografía ASTRA59. El resultado se binariza y se genera un soporte de objeto finito. En segundo lugar, se utiliza un algoritmo clásico de Gerchberg-Papoulis que es una versión iterativa del método de Inversión Directa (también conocido como transformada de Wolf)60. Este procedimiento iterativo se basa en el teorema de difracción de Fourier61 y utiliza una aproximación de dispersión de primer orden. Aquí, la reconstrucción y su transformada de Fourier se calculan alternativamente y se aplican restricciones: no negatividad y soporte de objetos finitos en el dominio de la señal, y reposición de las proyecciones originales en el dominio de la frecuencia.

Nuestro método principal para modelar la dispersión múltiple es el método de propagación de haz de múltiples cortes (MSBP)62, que recientemente ha mostrado resultados prometedores para la obtención de imágenes biológicas42,63. En nuestra primera implementación de MSBP, utilizamos exactamente el mismo conjunto de datos de campo eléctrico utilizado por GPSC desde arriba. Se selecciona una estimación inicial del RI 3D de la muestra para iniciar el procedimiento iterativo. Posteriormente, el método MSBP se utiliza para simular mediciones de dispersión resultantes de ondas planas que se propagan a través del RI 3D estimado inicial de la muestra. Los campos dispersos resultantes de esta simulación se comparan con los obtenidos experimentalmente con nuestros sistemas TPM. El error calculado entre las mediciones simuladas y experimentales se propaga hacia atrás a través de cada capa de la estimación de la muestra 3D para modificar incrementalmente el valor RI de cada vóxel. Las iteraciones continuas que repiten estos pasos eventualmente dan como resultado que la estimación de la muestra 3D converja a una solución estable en estado estacionario. Implementamos la MSBP con mediciones de campo eléctrico (MSBP-E) mediante el algoritmo de Tomografía de Aprendizaje (LT)42. El procedimiento LT es un algoritmo de optimización iterativo con una regularización de variación total (TV) débil adicional aplicada en cada iteración para garantizar la convergencia. Descubrimos que el método funciona mejor cuando se elige una suposición inicial como punto de partida para el proceso iterativo. En este artículo utilizamos el método de inversión directa para proporcionar la estimación inicial.

Trabajos recientes han demostrado que el paso de actualización de gradiente dentro del método MSBP se puede reformular para reconstruir RI 3D únicamente a partir de mediciones de intensidad no interferométricas31. Las ventajas clave de este método incluyen el uso de un sistema de imágenes no interferométricas, que son resistentes a las inestabilidades mecánicas que a menudo limitan el uso a largo plazo de interferómetros de doble brazo sin realineación. Además, la fuente de luz puede ser parcialmente coherente, para evitar artefactos moteados coherentes en las mediciones, manteniendo al mismo tiempo la coherencia suficiente necesaria para la reconstrucción de RI. Con el fin de demostrar la reconstrucción 3D de RI utilizando esta variante de MSBP de solo intensidad (a la que aquí nos referimos como MSBP-I), simplemente usamos el componente de amplitud de las mediciones del campo eléctrico utilizadas para las reconstrucciones GPSC y MSBP-E. descrito arriba. De manera similar a MSBP-E, la regularización de variación total se aplica en cada iteración. El punto de partida de MSBP-I es una matriz de ceros.

Todos los métodos de reconstrucción de TPM descritos son procedimientos iterativos que utilizan el mismo criterio de parada para finalizar automáticamente los cálculos. Este criterio es una modificación de un método presentado anteriormente64, y se describe en Alg. 1 a continuación. La intuición general detrás de este procedimiento es terminar el proceso de cálculo iterativo cuando la dinámica del cambio entre las estimaciones de muestras 3D generadas por iteraciones consecutivas cae por debajo de un cierto nivel de saturación \(\epsilon\). Para depender menos de los valores atípicos, se calcula el valor mediano de la dinámica de las últimas 10 iteraciones. El valor de \(\epsilon\) se elige empíricamente para cada algoritmo. Para GPSC \(\epsilon =0.02\), para LT y MS \(\epsilon =0.01\). Los valores de \(\epsilon\) se eligieron empíricamente para equilibrar la convergencia incompleta y la velocidad de reconstrucción.

Los datos subyacentes a los resultados presentados en este documento están disponibles en el Conjunto de datos 140.

Yoon, S. y col. Imágenes ópticas profundas dentro de medios de dispersión complejos. Naturaleza Rev. Phys. 2, 141-158 (2020).

ADS del artículo Google Scholar

Chatzinikolaidou, M. Esferoides celulares: las nuevas fronteras en modelos in vitro para la validación de fármacos contra el cáncer. Descubrimiento de drogas. Hoy 21, 1553-1560 (2016).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Pierré, W. et al. Imágenes de lapso de tiempo en 3D de un embrión de ratón mediante tomografía de difracción de intensidad integrada dentro de un marco de aprendizaje profundo. Aplica. Optar. 61, 3337 (2022).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Rios, AC & Clevers, H. Imagenología de organoides: un futuro brillante por delante. Métodos de la naturaleza 15, 24-26 (2018).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Dekkers, JF y cols. Imágenes 3D de alta resolución de organoides fijos y limpiados. Protocolos de la naturaleza 14, 1756-1771 (2019).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Lim, J. y col. Estudio comparativo de algoritmos de reconstrucción iterativa para problemas de conos perdidos en tomografía de difracción óptica. Optar. Expreso 23, 16933–16948 (2015).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Sung, Y. & Dasari, RR Regularización determinista de la tomografía por difracción óptica tridimensional. JOSA A 28, 1554–1561 (2011).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Hindi, H. Un tutorial sobre optimización convexa. En Actas de la Conferencia Americana de Control de 2004, vol. 4 3252–3265 (IEEE, 2004).

Lamont, AC y cols. Escritura láser directa de un fantasma de cono de retina cargado de dióxido de titanio para tomografía de coherencia óptica con óptica adaptativa. Optar. Madre. Expreso 10, 2757–2767 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

LaFratta, CN & Baldacchini, T. Metrología de polimerización de dos fotones: métodos de caracterización de mecanismos y microestructuras. Micromáquinas 8, 101 (2017).

Artículo PubMed Central Google Scholar

Horng, H. y col. Fantomas vasculares impresos en 3D para la evaluación de la calidad de imágenes biofotónicas de alta resolución mediante escritura láser directa. Optar. Letón. 46, 1987–1990 (2021).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Eifler, M., Hering, J., Von Freymann, G. & Seewig, J. Muestra de calibración para características metrológicas arbitrarias de instrumentos de medición de topografía óptica. Optar. Expreso 26, 16609–16623 (2018).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Vora, HD & Sanyal, S. Una revisión exhaustiva: Metrología en fabricación aditiva y tecnología de impresión 3D. Adición de progreso. Fabricar. 5, 319–353 (2020).

Artículo de Google Scholar

Bellec, M. y col. Supere el límite de difracción en escritura láser directa 3D en vidrio fotosensible. Optar. Expreso 17, 10304 (2009).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Kotz, F. y col. Impresión tridimensional de vidrio de sílice fundido transparente. Naturaleza 544, 337–339 (2017).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Jonušauskas, L. et al. Microfabricación híbrida de soldadura sustractiva-aditiva para aplicaciones de laboratorio en chip mediante una única fuente láser de femtosegundo amplificada. Optar. Ing. 56, 1 (2017).

Artículo de Google Scholar

Varapnickas, S. & Malinauskas, M. Procesos de nanolitografía 3D de escritura directa con láser. En Manual de microingeniería y nanoingeniería láser, vol. 12, 1–31 (Springer International Publishing, 2020).

Yang, L., Mayer, F., Bunz, UHF, Blasco, E. & Wegener, M. Micro y nanoimpresión láser 3D multimaterial y multifotónico. Luz: Avanzado. Fabricar. 2, 1 (2021).

Google Académico

Girshovitz, P. & Shaked, NT Parámetros morfológicos celulares generalizados basados ​​en microscopía de fase interferométrica y su aplicación a la caracterización del ciclo de vida celular. Biomédica. Optar. Expreso 3, 1757-1773 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, Y. et al. Tomografía óptica por difracción de camino común para la investigación de estructuras tridimensionales y dinámica de células biológicas. Optar. Expreso 22, 10398–10407 (2014).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Stanly, TA et al. Imágenes cuantitativas de tomografía por difracción óptica de plaquetas de ratón. Frente. Fisiol. 11, 568087 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Baczewska, M. y col. Método para analizar los efectos de la terapia con láser de baja intensidad en células biológicas con un microscopio holográfico digital. Aplica. Optar. 61, B297–B306 (2022).

Artículo PubMed Google Scholar

Baczewska, M., Eder, K., Ketelhut, S., Kemper, B. & Kujawińska, M. Cambios en el índice de refracción de células y compartimentos celulares tras la fijación de paraformaldehído adquiridos mediante microscopía de fase tomográfica. Citometría Parte A 99, 388–398 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Eder, K., Marzi, A., Barroso, Á., Kemper, B. y Schnekenburger, J. Impacto de las nanopartículas médicas en el desarrollo de masa seca temporal de macrófagos cuantificado in vitro mediante microscopía holográfica digital. En Quantitative Phase Imaging VII, vol. 11653 132–138 (SPIE, 2021).

Chen, B. & Stamnes, JJ Validez de la tomografía de difracción basada en las aproximaciones del primer Born y la primera de Rytov. Aplica. Optar. 37, 2996–3006 (1998).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Lee, M., Hugonnet, H. & Park, Y. Solucionador de problemas inversos para dispersión de luz múltiple utilizando series Born modificadas. Óptica 9, 177–182 (2022).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Liu, H.-Y. et al. Seagle: reconstrucción de imágenes basada en dispersión bajo dispersión múltiple. Traducción IEEE. Computadora. Imágenes 4, 73–86 (2017).

Artículo MathSciNet Google Scholar

Sun, Y., Xia, Z. y Kamilov, EE. UU. Inversión eficiente y precisa de dispersión múltiple con aprendizaje profundo. Optar. Expreso 26, 14678–14688 (2018).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Soubies, E., Pham, T.-A. & Unser, M. Inversión eficiente del modelo de dispersión múltiple para tomografía de difracción óptica. Optar. Expreso 25, 21786–21800 (2017).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Chen, M., Ren, D., Liu, H.-Y., Chowdhury, S. y Waller, L. Modelo de dispersión múltiple Born multicapa para microscopía de fase 3D. Óptica 7, 394–403 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Chowdhury, S. y col. Microscopía de índice de refracción 3D de alta resolución de muestras de dispersión múltiple a partir de imágenes de intensidad. Óptica 6, 1211 (2019).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Lim, J. y col. Más allá del límite de Born-Rytov para tomografía de difracción óptica de súper resolución. Optar. Expreso 25, 30445–30458 (2017).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Ziemczonok, M., Kuś, A., Wasylczyk, P. & Kujawińska, M. Fantasma celular biológico impreso en 3D para probar sistemas de imágenes de fase cuantitativa en 3D. Ciencia. República 9, 18872 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Schmid, M., Ludescher, D. & Giessen, H. Propiedades ópticas de fotorresistentes para impresión 3D de femtosegundos: índice de refracción, extinción, dependencia de la dosis de luminiscencia, envejecimiento, tratamiento térmico y comparación entre la exposición de 1 y 2 fotones. Optar. Madre. Expreso 9, 4564–4577 (2019).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Marakis, E. y col. Medios de dispersión fotónica deterministas y controlables mediante escritura láser directa. Adv. Optar. Madre. 8, 2001438 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Ziemczonok, M., Kuś, A. & Kujawińska, M. La tomografía por difracción óptica se une a la metrología: precisión de medición a nivel celular y subcelular. Medida 195, 111106 (2022).

Artículo de Google Scholar

Horstmeyer, R., Heintzmann, R., Popescu, G., Waller, L. y Yang, C. Estandarización de las afirmaciones de resolución para microscopía coherente. Fotón de la naturaleza. 10, 68–71 (2016).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Cotte, Y. et al. Nanoscopia de fase libre de marcadores. Fotón de la naturaleza. 7, 113-117 (2013).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Debailleul, M., Georges, V., Simon, B., Morin, R. y Haeberlé, O. Microscopía difractiva tomográfica tridimensional de alta resolución de muestras biológicas e inorgánicas transparentes. Optar. Letón. 34, 79–81 (2009).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Krauze, W., Kuś, A., Ziemczonok, M., Haimowitz, M., Chowdhury, S. y Kujawińska, M. Mediciones de tomografía óptica y reconstrucciones de un microfantasma impreso en 3D de dispersión múltiple. Zenodo (2022). https://doi.org/10.5281/zenodo.7233563.

Krauze, W. Tomografía por difracción óptica con soporte de objetos finitos para minimizar los artefactos de cono faltantes. Biomédica. Optar. Expreso 11, 1919-1926 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Kamilov, EE.UU. et al. Aproximación al aprendizaje de la tomografía óptica. Óptica 2, 517 (2015).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Helmchen, F. y Denk, W. Microscopía de dos fotones de tejido profundo. Métodos de la naturaleza 2, 932–940 (2005).

Artículo PubMed CAS Google Scholar

Rubart, M. Microscopía de dos fotones de células y tejidos. Circulo. Res. 95, 1154-1166 (2004).

Artículo CAS Google Scholar

Strong, D. & Chan, T. Propiedades de regularización de variación total que preservan los bordes y dependen de la escala. Problemas inversos 19, S165 (2003).

Artículo ADS MathSciNet MATH Google Scholar

Wang, Z. y col. Microscopía de interferencia luminosa espacial (delgada). Optar. Expreso 19, 1016–1026 (2011).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Tian, ​​L. & Waller, L. Imágenes cuantitativas de contraste de fase diferencial en un microscopio de matriz de LED. Optar. Expreso 23, 11394–11403 (2015).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Liao, C., Wuethrich, A. y Trau, M. Una odisea de materiales para nano/microestructuras 3D: nanolitografía basada en polimerización de dos fotones en bioaplicaciones. Aplica. Madre. Hoy 19, 100635 (2020).

Artículo de Google Scholar

Simon, B., Debailleul, M., Beghin, A., Tourneur, Y. & Haeberlé, O. Microscopía difractiva tomográfica de alta resolución de muestras biológicas. J. Biofotón. 3, 462–467 (2010).

Artículo de Google Scholar

Simón, B. et al. Microscopía tomográfica difractiva con resolución isotrópica. Óptica 4, 460–463 (2017).

ADS del artículo Google Scholar

Lauer, V. Nuevo enfoque de la tomografía de difracción óptica que produce una ecuación vectorial de la tomografía de difracción y un nuevo microscopio tomográfico. J. Microscopía 205, 165-176 (2002).

Artículo MathSciNet CAS Google Scholar

Kim, K. y col. Imágenes tridimensionales de alta resolución de glóbulos rojos parasitados por Plasmodium falciparum y cristales de hemozoína in situ mediante tomografía de difracción óptica. J. Biomed. Optar. 19, 011005 (2013).

Artículo PubMed Central Google Scholar

Wedberg, T. & Wedberg, W. Reconstrucción tomográfica de la distribución del índice de refracción transversal en fibras birrefringentes semitransparentes. J. Microsc. 177, 53–67 (1995).

Artículo de Google Scholar

Bunea, A.-I., del Castillo Iniesta, N., Droumpali, A., Wetzel, AE, Engay, E., & Taboryski, R.Microimpresión 3D mediante polimerización de dos fotones: configuraciones y parámetros para el sistema de nanoscribe . Micro 1, 164–180 (2021).

Kuś, A. Errores relacionados con la iluminación en tomografía de difracción óptica de ángulo limitado. Aplica. Optar. 56, 9247–9256 (2017).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Kuś, A., Krauze, W., Makowski, PL & Kujawińska, M. Tomografía holográfica: soluciones de hardware y software para imágenes biomédicas cuantitativas en 3D (artículo invitado). ETRI J. 41, 61–72 (2019).

Artículo de Google Scholar

Sánchez-Ortiga, E., Doblas, A., Saavedra, G., Martínez-Corral, M. & García-Sucerquia, J. Microscopía holográfica digital fuera de eje: parámetros de diseño prácticos para operar en el límite de difracción. Aplica. Optar. 53, 2058-2066 (2014).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Chambolle, A. & Pock, T. Un algoritmo dual primario de primer orden para problemas convexos con aplicaciones a la obtención de imágenes. J. Matemáticas. Imagen Vis. 40, 120-145 (2011).

Artículo MathSciNet MATEMÁTICAS Google Scholar

Van Aarle, W. y col. ASTRA Toolbox: una plataforma para el desarrollo de algoritmos avanzados en tomografía electrónica. Ultramicroscopía 157, 35–47 (2015).

Artículo PubMed Google Scholar

Wolf, E. Determinación de la estructura tridimensional de objetos semitransparentes a partir de datos holográficos. Optar. Comunitario. 1, 153-156 (1969).

ADS del artículo Google Scholar

Haeberlé, O., Belkebir, K., Giovaninni, H. & Sentenac, A. Microscopía difractiva tomográfica: conceptos básicos, técnicas y perspectivas. J. Opción moderna. 57, 686–699 (2010).

Artículo ADS MATEMÁTICAS Google Scholar

Van Roey, J., Van der Donk, J. & Lagasse, P. Método de propagación del haz: análisis y evaluación. JOSA 71, 803–810 (1981).

ADS del artículo Google Scholar

Kamilov, EE.UU. et al. Reconstrucción de imágenes tomográficas ópticas basada en propagación de haz y regularización escasa. Traducción IEEE. Computadora. Imágenes 2, 59–70 (2016).

Artículo MathSciNet Google Scholar

Makowski, PL y Ziemczonok, M. Rutina de extrapolación de proyección para tomografía de difracción óptica de ángulo limitado y marco estrecho. Optar. Letón. 44, 3442–3445 (2019).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Los autores quieren agradecer al prof. Maciej Szkulmowski de la Universidad Nicolaus Copernicus por brindar acceso a la fuente de luz infrarroja cercana utilizada en este trabajo. Los autores quieren agradecer a Demetri Psaltis y Joowon Lim de la École Polytechnique Fédérale de Lausanne por proporcionar el código para el algoritmo de tomografía de aprendizaje.

La investigación que condujo a los resultados descritos se llevó a cabo en el marco del programa TEAM TECH/2016-1/4 de la Fundación para la Ciencia Polaca, cofinanciado por la Unión Europea en el marco del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. El desarrollo del objeto de calibración fue financiado por el proyecto FOTECH-1 otorgado por la Universidad Tecnológica de Varsovia en el marco del programa Iniciativa de Excelencia: Universidad de Investigación (ID-UB). También agradecemos el apoyo de la Universidad de Texas en Austin, la Escuela de Ingeniería Cockrell y la Iniciativa Chan Zuckerberg.

Instituto de Micromecánica y Fotónica, Universidad Tecnológica de Varsovia, calle Boboli 8, Varsovia, 02-525, Polonia

Wojciech Krauze, Arkadiusz Kuś, Michał Ziemcjonok y Małgorzata Kujawińska

Departamento de Ingeniería Eléctrica, Universidad de Texas en Austin, 2501 Speedway, Austin, TX, 78712, EE. UU.

Max Haimowitz y Shwetadwip Chowdhury

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Crédito. WK: conceptualización, análisis formal, metodología, software, visualización, redacción – borrador original. AK: conceptualización, adquisición de fondos, investigación, metodología, administración de proyectos, visualización, redacción – borrador original. MZ: curación de datos, investigación, metodología, recursos, visualización, redacción – borrador original. MH: software, redacción, revisión y edición. SC: adquisición de financiación, software, redacción, revisión y edición. MK: adquisición de financiación, administración de proyectos, redacción, revisión y edición.

Correspondencia a Wojciech Krauze.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Krauze, W., Kuś, A., Ziemczonok, M. et al. Muestra de microfantasma de dispersión 3D para evaluar la precisión cuantitativa en técnicas de microscopía de fase tomográfica. Informe científico 12, 19586 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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Recibido: 31 de agosto de 2022

Aceptado: 11 de noviembre de 2022

Publicado: 15 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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