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Jul 11, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 2722 (2023) Citar este artículo

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Gran parte de nuestro conocimiento sobre el desarrollo, la estructura y la función de células y tejidos proviene de la microscopía de fluorescencia. La adquisición de imágenes coloridas y brillantes atrae y entusiasma a usuarios que van desde microscopistas experimentados hasta estudiantes de STEM. Los microscopios de fluorescencia tienen un coste que oscila entre varios miles y varios cientos de miles de dólares estadounidenses. Por lo tanto, el uso de la microscopía de fluorescencia generalmente se limita a instituciones y empresas de biotecnología bien financiadas, instalaciones centrales de investigación y laboratorios médicos, pero no es financieramente práctico en muchas universidades y colegios, escuelas primarias y secundarias (K-12) y en ciencias. entornos de extensión. En este estudio, desarrollamos y caracterizamos componentes que, cuando se usan en combinación con un teléfono inteligente o una tableta, realizan microscopía de fluorescencia a un costo de menos de 50 dólares estadounidenses por unidad. Reutilizamos linternas LED recreativas y filtros de iluminación de escenarios de teatro para permitir la visualización de fluoróforos verdes y rojos, incluidos EGFP, DsRed, mRFP y mCherry, en un marco de madera y plexiglás fácil de construir. Estos dispositivos, a los que nos referimos como luminoscopios, tenían una resolución de 10 µm, obtenían imágenes de fluorescencia en muestras vivas y eran compatibles con todos los modelos de teléfonos inteligentes y tabletas que probamos. En comparación con los microscopios de fluorescencia de grado científico, los luminoscopios pueden tener limitaciones en la sensibilidad necesaria para detectar fluorescencia tenue y la incapacidad de resolver estructuras subcelulares. Demostramos la capacidad de ver la fluorescencia dentro de los embriones de pez cebra, incluida la frecuencia cardíaca, la ritmicidad y la anatomía regional del sistema nervioso central. Debido al bajo costo de las unidades de luminoscopio individuales, anticipamos que este dispositivo puede ayudar a equipar las aulas de educación preescolar, de pregrado y de extensión científica con flotas de microscopios de fluorescencia que puedan involucrar a los estudiantes en actividades de aprendizaje práctico.

Los avances en la tecnología de cámaras de teléfonos inteligentes y tabletas han puesto cámaras potentes en manos de científicos, educadores y estudiantes. La resolución y sensibilidad de las cámaras de los teléfonos inteligentes y tabletas modernos superan las capacidades de muchas cámaras científicas que todavía se utilizan para aplicaciones de investigación. Con mejoras anuales en la sensibilidad de la cámara de los teléfonos inteligentes, la resolución y agrupación de píxeles y las capacidades de velocidad de fotogramas de video, estamos entrando en una era en la que estos dispositivos pueden realizar adquisiciones de imágenes y videos de alta calidad para la educación e investigación científica. En consecuencia, se han desarrollado productos para montar teléfonos inteligentes en oculares de microscopio para la adquisición de imágenes. Además, se han desarrollado diseños de 'microscopios para teléfonos inteligentes' independientes para su uso en entornos de educación científica desde jardín de infantes hasta grado 12 y de pregrado1,2,3,4,5,6, entornos clínicos o de investigación7,8,9,10,11 y aplicaciones de geociencias12. .

La microscopía de fluorescencia produce imágenes visualmente atractivas que pueden mejorar en gran medida el contraste de características específicas de la muestra que se está observando. Esta modalidad de obtención de imágenes microscópicas ha implicado históricamente lámparas de arco de mercurio o láseres costosos y engorrosos. Sin embargo, en los últimos años, la tecnología de diodos emisores de láser (LED), comparativamente económica y compacta, está reemplazando a las lámparas de arco de mercurio y a los láseres en la industria de la microscopía. Las ventajas incluyen menor costo, mayor longevidad y operación sin mantenimiento. Debido a que los LED han sido diseñados para emitir luz de prácticamente cualquier longitud de onda en el espectro de luz visible y pueden filtrarse si es necesario, la comunidad de microscopía está adoptando ampliamente el uso de LED como fuente de luz de excitación para microscopía de fluorescencia.

En este estudio, nuestro objetivo era desarrollar una configuración de imágenes de fluorescencia para teléfonos inteligentes con un precio de construcción objetivo de menos de 50 dólares estadounidenses por unidad. Demostramos la capacidad de estos dispositivos, a los que nos referimos como "glowscopes", para detectar fluoróforos verdes y rojos y para monitorear y detectar cambios en la frecuencia cardíaca y el ritmicidad en embriones de pez cebra. Discutimos y demostramos oportunidades para que los educadores de pregrado y K12 utilicen estos recursos para cumplir con los estándares científicos locales y de próxima generación.

Todo el trabajo con pez cebra realizado en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Winona. Todos los experimentos se realizaron en estricta conformidad con las pautas y regulaciones de este protocolo de uso y cuidado de animales y las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org/). No participaron participantes humanos en el estudio de investigación. Se criaron embriones de pez cebra (Danio rerio) a 28 °C en agua de huevo (0,0623 g/L de sal marina de Coralife) y se estadificaron según las horas posteriores a la fertilización o criterios morfológicos. Las líneas transgénicas utilizadas en este estudio incluyeron Tg(olig2:DsRed)vu19, Tg(nkx2.2a:EGFP-CaaX)vu16, Tg(phox2bb:EGFP)w37, Tg(mbpa:EGFP-CaaX; myl7:mCherry) en adelante denominadas como Tg(myl7:mCherry)13, Tg(sox10:mRFP)vu234 y Tg(UAS:EGFP-CaaX, myl7:EGFP)co18, que en lo sucesivo se denominará Tg(myl7:EGFP). Para paralizar reversiblemente embriones y larvas para su visualización, se añadió solución madre de metanosulfonato de tricaína (Western Chemical, Inc.) (0,116 M) directamente a la placa de Petri que contenía agua de huevo en una proporción de 0,5 a 1 ml (tricaína) en 20 ml (huevo). agua). Se usó una solución madre de astemizol (10 mM en DMSO) para tratar el pez cebra mediante adición directa al agua del huevo para una concentración final de 10 o 30 µM (como se indica). Todos los demás animales utilizados en este estudio se recolectaron localmente antes de su uso. La visualización de insectos vivos contenidos en placas de Petri se ayudó colocando la placa sobre hielo para ralentizar el movimiento. Se utilizó un ReptiTherm UTH para aumentar la temperatura en los estudios de frecuencia cardíaca (Zoomed). La superficie de esta almohadilla térmica se midió a 35 °C en el momento de su uso utilizando un termómetro infrarrojo. El tratamiento de embriones de pez cebra con agua ácida se realizó utilizando vinagre doméstico (10% en agua de huevo) durante 30 minutos entre la determinación de la frecuencia cardíaca antes y después del tratamiento. Para el comportamiento inducido por las presas de los peces, se colocó una única larva de pez cebra (5 dpf) en una placa de Petri de 30 mm que contenía 5 ml de agua de huevo. Para observar la captura de presas del pez cebra, se premezcló Paramecium bursaria (Carolina Biologicals) vivo directamente con el agua del huevo a una concentración de 30 paramecium por 1 ml, que se determinó antes de su adición mediante observación microscópica de muestras por triplicado y se diluyó para lograr esta concentración objetivo.

Una lista completa de piezas, información de diseño y ensamblaje está disponible en los Métodos complementarios. Brevemente, se ensamblaron madera contrachapada cortada o material compuesto con una superficie de plexiglás (policarbonato o acrílico). Se perforaron agujeros en el plexiglás para proporcionar un puerto de visualización claro para la cámara del teléfono inteligente. Se cortó una pieza adicional de plexiglás para que sirviera como plataforma de escenario móvil inmovilizada por arandelas y abrazaderas. Se utilizó una lente macro con clip (Lieront, comprada en www.amazon.com, anunciada como macro 25X) para agregar aumento a las imágenes de teléfonos inteligentes para lograr fluorescencia. Se utilizó una tabla de pruebas de la USAF de 1951 (www.edmundoptics.com, catálogo n.º 3857) para determinar la resolución máxima de imagen alcanzada. Después de adquirir la imagen con el máximo zoom digital, determinamos las líneas más pequeñas que podían separarse claramente y los lp/mm que representan (x). La resolución (en micras) se calculó de la siguiente manera: µm = 1000 / (x * 2).

Para la iluminación de GFP se utilizó una linterna frontal LED azul (Topme, comprada en www.amazon.com, anunciada como linterna frontal para pesca) o una linterna LED multicolor (Lumenshooter, comprada en www.amazon.com, anunciada como linterna táctica) . Para reducir la luz parásita en las longitudes de onda verde y amarilla, se cortó e insertó una película de iluminación en gel para escenarios de teatro (Rosco #4990, CalColor Lavender) entre el LED y la lente de enfoque del faro. Se utilizaron películas de gel para iluminación de escenarios de teatro Rosco #14 (Paja mediana) y #312 (Canary) individualmente o en combinación como filtros de emisión. La lámpara LED se sostuvo en un ángulo de aproximadamente 45 grados por encima y entre 3 y 6 pulgadas de las muestras. Se colocaron filtros de emisión entre la plataforma acrílica y la lente con clip. Para obtener imágenes de proteínas fluorescentes rojas, se usaron Rosco #88 (verde claro) y #89 (verde musgo) para iluminación (filtros de excitación) junto con #19 (fuego) como filtro de emisión. Todos los filtros Rosco se compraron en www.stagelightingstore.com o www.bhphotovideo.com. Se utilizó un espectrómetro de emisiones Vernier (VSP-EM, www.vernier.com) para evaluar los efectos de los filtros de excitación. Se utilizó el software Vernier Spectral Analysis (versión 4.11.0–1543) para adquirir y convertir datos al formato .csv, que luego se importó a Microsoft Excel y posteriormente se utilizó para realizar trazados utilizando GraphPad Prism (versión 7.0, GraphPad). Se utilizó un Vernier LabPro acoplado a un sensor de luz (Vernier LS-BTA) para evaluar la intensidad de la luz de linternas LED azules en combinación con el software Vernier Logger Pro 3 (versión 3.16.2). Se utilizó un multímetro (Amprobe 30XR-A) para medir el consumo de corriente entre la batería y el LED del faro LED azul.

Para la adquisición de imágenes se utilizaron dispositivos Apple y Samsung. A menos que se indique lo contrario, toda la adquisición de imágenes se realizó con un iPhone XR (Apple). Para mayor comodidad, se adquirieron vídeos en lapso de tiempo del corazón embrionario del pez cebra utilizando la aplicación ProCam 8, que permitió bloquear la lente 1X para su uso y ampliar el zoom digital a 4,0X. Se utilizó la adquisición de vídeo con una resolución de 1080p y 60 fotogramas por segundo (fps) porque una resolución de 4k o velocidades de fotogramas superiores disminuyeron la sensibilidad de fluorescencia y la relación señal:ruido. Todas las imágenes y videos se transfirieron a una computadora portátil mediante Airdrop (Apple) o un cable USB para evitar la compresión de datos de video. Los videos se importaron a Fiji14 convirtiendo primero los videos a una serie de imágenes TIFF (una por cuadro) usando Adobe Photoshop. Después de abrir videos de teléfonos inteligentes en Photoshop, las imágenes se recortaron y luego se guardaron como una secuencia de imágenes usando el comando Archivo Exportar Render Video Secuencia de imágenes de Photoshop (formato TIFF). Luego, la secuencia de imágenes se abrió en Fiji mediante el comando Archivo Importar secuencia de imágenes. Para la visualización en intervalos de tiempo no fluorescente de paramecios, natación del pez cebra y respuestas de escape de renacuajos y orugas, utilizamos una resolución de 1080p con adquisición de 120 fps.

En el caso de los vídeos del corazón del pez cebra, la detección de bordes ayudó a la detección y medición de los movimientos de la cámara del corazón en algunos vídeos. En estos casos, se utilizó Fiji para detectar bordes mediante el comando Procesar buscar bordes. Para detectar cambios de fluorescencia asociados con los movimientos de la aurícula y el ventrículo, se utilizó y analizó más a fondo en Fiji la secuencia de imágenes sin procesar o detectadas en los bordes. En primer lugar, se utilizó el comando Analizar conjunto de medidas para indicarle a Fiji que midiera los valores de gris mínimos y máximos, los valores de gris medios y el límite al umbral. La pila de imágenes se convirtió a escala de grises mediante el comando Tipo de imagen de 8 bits. En los casos en los que se produjeron cambios de imagen o movimientos no biológicos, se utilizó el comando Estabilizador de imagen de complementos para intentar eliminar este problema. La imagen se escaneó en busca de posibles regiones de interés (ROI) donde las paredes de la cámara cardíaca se movían constantemente hacia adelante y hacia atrás a lo largo del eje x-y. Una vez que se definió un ROI, se agregó usando la ventana del administrador de ROI de las herramientas de análisis o el acceso directo "t". Al mismo tiempo que se identificaba una ROI, se utilizó la ventana Umbral de ajuste de imagen para establecer un umbral mediante el cual las paredes móviles de la cámara entraban y salían consistentemente del cuadro de ROI. Una vez que se estableció una combinación ideal de umbral de imagen y posición del cuadro de ROI, la imagen se convirtió en datos binarios usando el comando Procesar binario seleccionando la configuración de fondo predeterminada, oscura y negra. Para medir la intensidad de la fluorescencia dentro del ROI a lo largo del tiempo, se utilizó la herramienta Multi Measure dentro del administrador de ROI (en la pestaña "Más") para crear un conjunto de mediciones a lo largo del tiempo. Los datos sin procesar se cortaron y pegaron directamente en una hoja de cálculo de Microsoft Excel. Dentro de la hoja de cálculo, se usaron fórmulas para identificar el inicio de cada latido usando la columna de intensidad máxima y se realizaron gráficos usando GraphPad Prism 7.0. El inicio de cada latido estuvo definido por la transición de 0 a 255.

Como marco para soportar un teléfono inteligente o una tableta para visualización de fluorescencia, adaptamos un diseño de microscopio de bricolaje que se usa ampliamente para imágenes no fluorescentes3,4. Este marco consistía en una plataforma de plexiglás para sostener un teléfono inteligente (o tableta) encima de la muestra (Fig. 1a). Un segundo

Vista en vivo de especímenes no fluorescentes utilizando el marco del luminoscopio. (a) La ilustración muestra la trayectoria de la luz para la visualización con luz transmitida. Los componentes que se muestran incluyen el teléfono inteligente, la lente con clip (negra), el marco del luminoscopio (gris), el escenario y la plataforma de visualización (transparente), la placa de Petri que contiene una muestra y una lámpara de trabajo LED colocada debajo del escenario y la plataforma de visualización. (b) La vista de imagen con la cámara de un teléfono inteligente sin lente de clip muestra embriones de pez cebra (flecha azul, 3 dpf). Se muestra un lápiz estándar (lado del borrador) como referencia de tamaño. (c) La vista de imagen usando la lente con clip adicional muestra los mismos embriones de pez cebra y el mismo borrador de lápiz que se ven en el panel (b). Las imágenes que se muestran en los paneles (b-c) son aumentos nativos (no ampliados) como se ven en vista en vivo, adquiridas con un Apple iPhone 12 Pro con lente de 1x (aumento medio) y zoom digital de 6x.

La plataforma de plexiglás colocada debajo de la lente del teléfono inteligente sirvió como escenario para sostener la muestra. La altura ajustable de la platina de plexiglás aseguró la capacidad de enfocar la muestra. Tableros de madera o compuestos, tuercas, pernos y arandelas mantuvieron la plataforma de plexiglás y el escenario en su lugar. Para imágenes no fluorescentes, una lámpara de trabajo LED alimentada por batería colocada debajo de la muestra proporcionó luz adicional cuando la iluminación ambiental de la habitación era insuficiente (Fig. 1a).

Para aumentar el aumento y la resolución más allá del teléfono inteligente o la tableta, se colocó una lente macro "con clip" adicional sobre la cámara del teléfono o la tableta (Fig. 1a, c). La lente con clip adicional utilizada en este estudio proporcionó un aumento de aproximadamente cinco veces (Fig. 1b-c). Esta magnitud dependió de la distancia a la que se colocó la muestra desde la lente con clip. Al observar el pez cebra embrionario (2 a 4 días después de la fertilización), que son aproximadamente equivalentes a la longitud de un borrador de lápiz (2 a 3 mm de largo), el aumento de aumento y la resolución de la imagen hicieron que las características del plan corporal del pez cebra se observaran fácilmente. Por ejemplo, las estructuras anatómicas, incluidos el ojo, el corazón, la yema y la cola, se observaron fácilmente en la pantalla en vivo utilizando la lente con clip (Fig. 1c). Utilizando objetivos de prueba de la USAF, medimos una resolución de 9,8 µm con una cámara de iPhone 11 con la lente con clip agregada. Esto correspondió a mejoras significativas en la resolución de la imagen y los detalles anatómicos en visualización en vivo o después de la adquisición de la imagen. Después de capturar las imágenes y estirarlas digitalmente para ampliarlas aún más en la pantalla de un teléfono inteligente o una computadora portátil, la lente con clip resolvió fácilmente estructuras anatómicas e incluso células pigmentarias individuales (melanocitos). En comparación, sin la lente con clip, estas mismas características eran difíciles o imposibles de ver (Figura complementaria S1).

Para equipar el alcance del teléfono inteligente con capacidad de imágenes de fluorescencia, a continuación agregamos fuentes y filtros de luz de fluorescencia. Para ver muestras con fluorescencia verde, apagamos la luz de trabajo LED y en su lugar utilizamos un faro o linterna LED azul (Fig. 2a). Usamos filtros de iluminación del escenario del teatro para impedir que la luz azul llegue a la lente de la cámara. Para hacerlo, colocamos el filtro inmediatamente debajo de la lente con clip y del teléfono inteligente (Fig. 2a). Estos 'filtros de emisión' económicos redujeron el fondo de fluorescencia de la linterna azul y al mismo tiempo permitieron que la fluorescencia verde de la muestra pasara a través del filtro y llegara a la cámara. Inicialmente obtuvimos un paquete de muestra de filtros de iluminación para escenarios de teatro con una amplia gama de propiedades espectrales. Después de probar numerosas opciones de color de filtro, descubrimos que la combinación de

Uso de linternas LED recreativas y filtros de iluminación de escenarios de teatro para microscopía de fluorescencia verde de teléfonos inteligentes. (a) Esquema de los componentes utilizados para la visualización de fluorescencia verde en el luminoscopio. (b – d) Imágenes de fluorescencia representativas de embriones de pez cebra transgénicos (3–4 dpf, vistas laterales) que expresan fluorescencia verde en patrones específicos de tipo celular. Las líneas reporteras vistas incluyen Tg(nkx2.2a:memGFP) (b), Tg(myl7:EGFP) (c) y Tg(phox2b:EGFP) (d). (e) La imagen muestra el luminoscopio en uso para la visualización de fluorescencia verde. (f – g) Los gráficos muestran la longitud de onda de emisión de la linterna LED azul (líneas negras y azules, medidas con un espectrómetro Vernier) en comparación con el perfil de excitación de EGFP (gris, obtenido de www.fpbase.org). La región del cuadro discontinuo en el panel (f) se amplía aún más en el panel g para mostrar el efecto del filtro R4990 con mayor detalle. Las imágenes de los paneles (b – d) se adquirieron utilizando un Apple iPhone XR.

Los filtros de iluminación de escenario Rosco #14 y #312 bloquearon efectivamente la luz azul y al mismo tiempo permitieron que una señal de fluorescencia verde robusta se transmitiera a la cámara (Fig. 2a). Para probar la funcionalidad de esta configuración, utilizamos líneas reporteras de pez cebra transgénico que expresaban proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en subconjuntos de tejidos o células neurales. Por ejemplo, la configuración de fluorescencia detectó fácilmente la fluorescencia del cerebro y la médula espinal en embriones Tg(nkx2.2a:memGFP), tejido cardíaco en embriones Tg(myl7:EGFP), y tenía una sensibilidad adecuada para detectar EGFP expresada en una subregión del rombencéfalo embrionario en embriones Tg (phox2b: EGFP) (Fig. 2b-d). Para reducir aún más la fluorescencia de fondo y mejorar la relación señal:ruido, agregamos el filtro Rosco 4990 colocado entre la linterna LED azul y la muestra (Fig. 2a). Como anécdota, este filtro de "excitación" oscureció el fondo azul verdoso con una pérdida insignificante de fluorescencia verde emitida y transmitida a la cámara del teléfono inteligente y a la imagen visualizada. Usando un espectrómetro Vernier, encontramos que el filtro de excitación agregado redujo ligeramente la intensidad de la fluorescencia del LED entre 460 y 500 nm (Fig. 2f-g). Esto puede explicar la reducción de la fluorescencia de fondo azul en las imágenes visualizadas cuando se utilizó el filtro de excitación R4990. Aunque este filtro de excitación adicional no es necesario para la visualización de fluorescencia verde, puede reducir eficazmente el fondo y mejorar la relación señal:ruido al observar muestras con fluorescencia tenue. Para evaluar más a fondo el perfil del faro LED azul, medimos el consumo de corriente en 2,5 A y la intensidad de la luz en 492 lx. Estas mediciones están dentro del rango que justifica la prevención de la exposición ocular directa y prolongada (ver 'Discusión').

También probamos LED y filtros de iluminación de escenario para ver la fluorescencia roja (Fig. 3). En lugar de una linterna azul, utilizamos una linterna LED verde. Como filtro de emisión colocado debajo de la lente, utilizamos el filtro de iluminación de escenario n.° 19 de Rosco para bloquear la luz verde y al mismo tiempo permitir que la fluorescencia roja pase a la lente de la cámara (Fig. 3a). En nuestras manos, este filtro de emisión funcionó mejor cuando se duplicó y proporcionó una visualización clara de la fluorescencia de líneas de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes rojas. Como ejemplos, esta configuración iluminó eficazmente las características del cerebro y la médula espinal de los embriones Tg(olig2:DsRed), la fluorescencia del corazón en los embriones Tg(myl7:mCherry) y la fluorescencia del esqueleto de la cabeza y la mandíbula (cresta neural craneal) en los Tg(sox10:mRFP). embriones (Fig. 3b-d). La linterna LED que utilizamos anunciaba una excitación LED de 530 nm, que entre los fluoróforos que utilizamos se alineaba mejor con las propiedades espectrales de DsRed. En nuestras manos, la linterna verde y los filtros de iluminación del escenario Rosco se combinaron mejor con DsRed, pero algo menos bien con las proteínas fluorescentes desplazadas al rojo mRFP y mCherry (Fig. 3b-d). La fluorescencia de fondo y la relación señal:ruido mejoraron marginalmente al cubrir la linterna con los filtros Rosco n.° 88 y n.° 89 (Fig. 3a). Este filtrado de excitación redujo la intensidad de la fluorescencia en longitudes de onda entre 540 y 580 nm (Fig. 3f-g) y puede explicar la disminución de la fluorescencia de fondo observada en las imágenes adquiridas cuando se utilizaron los filtros de excitación. Aunque los filtros de excitación n.° 88 y n.° 89 mejoraron la calidad de la imagen y la detección de fluorescencia tenue, no eran necesarios para obtener imágenes de fluorescencia roja en nuestras manos.

Detección con luminoscopio de proteínas fluorescentes rojas. (a) Esquema de los componentes utilizados para la visualización de fluorescencia roja en el luminoscopio. En comparación con la visualización de fluorescencia verde, la linterna y los filtros se cambian, pero el resto del telescopio luminoso no cambia. (b – d) Imágenes de fluorescencia representativas de embriones de pez cebra transgénicos (3 a 4 dpf, vistas laterales) que expresan fluorescencia roja en patrones específicos de tipo celular. Las líneas reporteras vistas incluyen Tg(olig2:DsRed) (b), Tg(myl7:mCherry) (c) y Tg(sox10:mRFP) (d). La barra de escala es de 1 mm. (e) La imagen muestra el luminoscopio en uso para la visualización de fluorescencia roja. (f – g) Los gráficos muestran la longitud de onda de emisión de la linterna LED verde (líneas negra y verde, medidas con un espectrómetro Vernier) en comparación con el perfil de excitación de DsRed (gris, obtenido de www.fpbase.org). La región del cuadro discontinuo en el panel (f) se amplía aún más en el panel (g) para mostrar el efecto de los filtros R88 + R89 con mayor detalle. Las imágenes de los paneles (b – c) se adquirieron con un Apple iPhone XR y el panel (d) se adquirieron con un iPhone 12 Pro.

Las piezas necesarias para convertir un teléfono inteligente o una tableta en un microscopio de fluorescencia se resumen en la Fig. 4. En el momento de nuestras pruebas y preparación del manuscrito, las piezas necesarias se adquirieron por un total de $ 30 a 50 USD por luminoscopio individual (Fig. 4a). ). Se cortó y perforó madera y plexiglás con herramientas básicas. Los filtros de iluminación para escenarios de teatro se compraron en láminas grandes y se cortaron a medida, lo que resultó en un costo de menos de $0,10 USD por unidad de filtro para esta aplicación. Las linternas LED azules y verdes estaban disponibles en minoristas en línea para aplicaciones tácticas, de caza y pesca. Probamos numerosas opciones y descubrimos que aquellas con luz azul en lugar de luz ultravioleta funcionaban mejor para ver proteínas fluorescentes verdes. Nuestra fuente de luz preferida era una linterna táctica multicolor con colores azul (454 nm) y verde (530 nm), que se vendía por 20 dólares en el momento en que se realizaron estos estudios. Al contactar directamente a los vendedores y comprar al por mayor, organizamos la compra directa al costo mayorista (~ 50% de descuento). Se pueden encontrar detalles adicionales sobre piezas e instrucciones de construcción en los Métodos complementarios.

Resumen de los componentes del Glowscope y compatibilidad con teléfonos inteligentes. (a) La tabla muestra los componentes básicos y los costos (al momento de este estudio) en dólares estadounidenses. (b) Imágenes representativas de embriones de pez cebra Tg(phox2b:EGFP) demuestran compatibilidad con todos los dispositivos probados, pero diferencias sutiles entre varias tabletas y teléfonos inteligentes utilizados para las pruebas. La barra de escala es de 1 mm.

Para evaluar la compatibilidad del luminoscopio con diferentes dispositivos de cámara, a continuación probamos las capacidades de visualización de fluorescencia utilizando varios modelos de teléfonos inteligentes y tabletas para detectar fluorescencia verde en embriones Tg (phox2b: EGFP). De las líneas reporteras verdes probadas inicialmente (Fig. 2b-d), Tg (phox2b: EGFP) fue la más difícil de ver porque la expresión de fluorescencia verde solo está presente en una parte del rombencéfalo embrionario. Todos los dispositivos probados, incluidos los teléfonos y tabletas Samsung, Apple, Google y Motorola, detectaron la sutil fluorescencia verde en el rombencéfalo (Fig. 4b). Los dispositivos más nuevos generalmente adquirieron imágenes de fluorescencia con intensidades de verde más brillantes en comparación con la fluorescencia de fondo, pero estas diferencias fueron sutiles. Concluimos que el uso de los modelos más nuevos de teléfonos inteligentes o tabletas no es necesario para la visualización de fluorescencia con luminoscopio.

A continuación, probamos la capacidad del telescopio luminoso para detectar cambios en la frecuencia cardíaca y la ritmicidad utilizando imágenes de fluorescencia verde en embriones de pez cebra. Debido a que el reportero Tg (myl7: EGFP) expresa fluorescencia verde en los cardiomiocitos, el resplandor y la pantalla en vivo del teléfono inteligente hicieron que los movimientos de la cámara del corazón latieran claramente observables con el tiempo (Fig. 5a). Para determinar si la configuración de imágenes era capaz de detectar cambios en la frecuencia cardíaca inducidos por fármacos, realizamos una visualización previa y posterior antes y después de 30 minutos de tratamiento con astemizol (Fig. 5b). Anteriormente conocido como Hismanal, el astemizol se usaba comúnmente como un medicamento antihistamínico para la alergia, pero fue retirado del mercado en 1999 porque causaba complicaciones cardíacas raras pero fatales, como el síndrome de QT largo, arritmias cardíacas y taquicardia potencialmente mortal15. Estos efectos secundarios en humanos fueron causados ​​porque el astemizol bloquea los canales de K+ de tipo ERG involucrados en la repolarización del potencial de acción cardíaco16, además de su modo de acción antihistamínico. Estudios anteriores han demostrado que el tratamiento con astemizol provoca bradicardia dependiente de la dosis y el tiempo seguida de un eventual bloqueo auriculoventricular 2:1 (arritmia) y paro cardíaco en embriones de pez cebra17. Utilizando la visualización de fluorescencia de teléfonos inteligentes del pez cebra Tg (myl7: EGFP) en tiempo real, detectamos una reducción significativa de la frecuencia cardíaca después de un tratamiento con astemizol de 30 minutos (Fig. 5b-c). Esta bradicardia inducida por el tratamiento farmacológico se observó de manera similar mientras se grababa el video (vista en vivo), al observar el video grabado en reproducción en la pantalla del teléfono inteligente o al transferir la grabación de video para verlo en la pantalla de una computadora portátil (Fig. 5d).

Detección con luminoscopio de cambios inducidos por fármacos en la frecuencia cardíaca en embriones de pez cebra transgénicos. (a) La imagen de fluorescencia izquierda muestra la expresión de GFP en el corazón de un embrión Tg(myl7:EGFP) (vista ventral). La región del cuadro se amplía aún más en la columna del medio, que de arriba a abajo muestra los movimientos de la cámara a través de un video adquirido en un teléfono inteligente iPhone 11 Pro. Para ayudar a ver los movimientos de las cámaras, estos videos se transfirieron a una computadora portátil, se abrieron en ImageJ (software gratuito) y se procesaron mediante detección de bordes, que delinea las paredes de las cámaras. Las flechas estáticas resaltan los movimientos de la cámara del corazón. (b) Diagrama de flujo de las imágenes previas y posteriores de la frecuencia cardíaca del pez cebra en respuesta al tratamiento con astemizol (10 µM). (c) Los gráficos muestran la frecuencia cardíaca promedio de embriones de pez cebra antes y después del tratamiento con astemizol. n = 10 animales medidos en un experimento independiente, P = 0,0002, prueba t de dos colas pareada. (d) Resumen de las mediciones realizadas durante la grabación del video en tiempo real (barra izquierda), vistas en el teléfono inteligente después de grabar el video (barra central) o vistas en una computadora portátil (barra derecha). N = 10 animales medidos en un experimento independiente, P = 0,942, ANOVA unidireccional. Para los paneles (c-d), los puntos del diagrama de dispersión representan mediciones de frecuencia (cardíaca) del pez cebra individual y las barras de error representan la desviación estándar.

Para probar más a fondo las capacidades y limitaciones de la fluorescencia de los teléfonos inteligentes, a continuación evaluamos la capacidad de resolver por separado las tasas de contractilidad de la cámara de la aurícula y del ventrículo, lo que predijimos que podría ser beneficioso para detectar arritmias cardíacas. En la mayoría de las grabaciones de video que capturamos, los movimientos de las cámaras individuales eran claramente visibles en algunos, pero no en todos, los embriones y superaron las limitaciones del luminoscopio. Para mejorar la claridad y la detección de los movimientos de la cámara, transferimos los videos del teléfono inteligente a una computadora que ejecuta el software ImageJ (también conocido como Fiji), disponible gratuitamente. En Fiji, el comando "buscar bordes" proporcionó un medio sencillo para delinear los bordes de las cámaras del corazón y sus movimientos a lo largo del tiempo (Fig. 6a-c). Al monitorear los cambios de intensidad de la fluorescencia específicamente dentro de una pequeña región de interés (ROI), detectamos movimientos oscilantes de la pared de la cámara cardíaca dentro y fuera del ROI a lo largo del tiempo (Fig. 6c-d). Este método proporcionó una separación clara de las tasas de contractilidad auricular y ventricular utilizando el dispositivo de teléfono inteligente (Fig. 6c-d). Los gráficos generados a partir de vídeos grabados antes y después del tratamiento con astemizol mostraron diferencias notables. Antes del tratamiento, ambas cámaras latían rápidamente y con un patrón alterno. En comparación, el tratamiento de 30 minutos con una dosis alta de astemizol (30 µM) causó bradicardia y arritmia severas, como lo demuestra el estancamiento del ventrículo durante cada dos latidos de la aurícula (Fig. 6d).

Detección con luminoscopio de arritmia cardíaca inducida por fármacos. (a–b) Imágenes fijas de un vídeo con luminoscopio (adquirido en un iPhone 11 Pro) muestran las cámaras de la aurícula y el ventrículo en un embrión de pez cebra Tg(myl7:EGFP) de 3 dpf. Las imágenes muestran la vista sin editar (sin editar) de la fluorescencia del corazón directamente desde la grabación de video de un teléfono inteligente (a) o una vista procesada del mismo corazón después de que se realizó la detección de bordes en una computadora usando Fiji (b). Los rectángulos azul y magenta muestran las regiones de las cámaras del ventrículo y la aurícula utilizadas para la visualización y el análisis con gran aumento en (c-d). (c) Las imágenes muestran un curso temporal (de arriba a abajo) de los movimientos de la cámara del ventrículo (izquierda) o de la aurícula (derecha) detectados por el luminoscopio (correspondientes a las regiones encuadradas en el panel b). Las pequeñas regiones de interés marcadas con guiones se utilizaron para monitorear los cambios de intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo. Los asteriscos resaltan los fotogramas donde la pared de la cámara cardíaca se ha movido hacia la región de interés con respecto al fotograma anterior. (d) Los gráficos de intensidad de fluorescencia frente al tiempo trazados para la cámara de la aurícula y el ventrículo revelan movimientos oscilantes de la cámara. Las mediciones dentro del mismo embrión (N = 1) se adquirieron y analizaron por separado antes (superior) y después del tratamiento con astemizol (inferior). La intensidad máxima de fluorescencia (en unidades arbitrarias) dentro de la región de interés del cuadro de guiones que se muestra en el panel (c) se obtuvo y se representó para cada período de tiempo de la grabación de video, lo que resultó en un pico de fluorescencia cada vez que la fluorescencia de la cámara entró y ocupó la zona. región de interés encuadrada. Tenga en cuenta las diferencias en la frecuencia cardíaca entre los corazones de control y tratados con astemizol, así como el patrón de latido auricular:ventricular arrítmico 2:1 inducido por el tratamiento con astemizol (gráfico inferior, 30 µM). Las flechas azules en el panel (d) muestran latidos ventriculares perdidos. Vídeos disponibles en el vídeo complementario S1.

Además de su uso para microscopía de fluorescencia, el marco del luminoscopio y la lente con clip también pueden ser útiles para observar muestras no fluorescentes y se han utilizado ampliamente en algunos entornos de divulgación científica3,4. En nuestras manos, una lámpara de trabajo LED colocada debajo de la muestra funcionó bien para muestras transparentes como embriones y larvas de pez cebra (Figs. 1, 2, Fig. Suplementaria S2). Reconociendo que la luz transmitida puede ser ineficaz para ver muestras no transparentes, a continuación comparamos opciones de iluminación alternativas para muestras transparentes y no transparentes. Al observar especímenes como renacuajos o insectos, descubrimos que era ventajoso colocar la luz al lado o encima (epi-iluminación) del espécimen (Figura complementaria S2). Cualquiera de las opciones se puede lograr sosteniendo con la mano la lámpara de trabajo LED en la posición deseada. Como una opción más conveniente para la epiiluminación, reutilizamos tiras de luces LED COB alimentadas por USB (consulte Métodos complementarios). Estas luces económicas normalmente se venden para la iluminación de gabinetes y armarios domésticos y tienen un respaldo adhesivo (cinta), lo que nos permitió fijarlas debajo del plexiglás inmediatamente encima de la muestra (Figura complementaria S2). Estas opciones de iluminación alternativas pueden ser útiles cuando se desea versatilidad del tipo de espécimen, pero no eran necesarias para nuestra observación de embriones y larvas de pez cebra.

Los Glowscopes pueden ser adecuados para algunas aplicaciones de investigación, pero nuestro principal motivador para su desarrollo fue satisfacer las necesidades de los educadores científicos y los programas de extensión. En Estados Unidos, las recomendaciones para la educación en ciencias de la vida en los niveles K-12 y de pregrado implican aumentar el aprendizaje activo y práctico18. Estas recomendaciones restan importancia a la transferencia de información basada en conferencias como único medio para el aprendizaje de los estudiantes y, en cambio, sugieren que los estudiantes aprendan ciencias aplicando ellos mismos el método científico de forma iterativa. Un desafío inherente a esta transformación pedagógica es la mayor presión sobre los docentes para desarrollar nuevas actividades de aprendizaje práctico que sean atractivas y apoyen los objetivos de aprendizaje basados ​​en la disciplina. El luminoscopio puede ser una de las muchas herramientas que son económicas, interesan y entusiasman a los estudiantes y pueden apoyar el aprendizaje práctico en las aulas. Para facilitar su opción, hay videos que documentan su uso y las instrucciones de ensamblaje disponibles en un canal de luminoscopios alojado en YouTube en https://www.youtube.com/channel/UCoRglCdvrtqwkBcvP10ibDg.

Para evaluar oportunidades potenciales para su uso, primero examinamos los Estándares Científicos de Próxima Generación (NGSS) K-12. Identificamos ideas disciplinarias básicas de NGSS compatibles con el uso de luminoscopios en los niveles de grado 1, 3, MS (escuela intermedia, grados 6 a 8) y HS (escuela secundaria, grados 9 a 12), y desarrollamos una tabla de actividades de aprendizaje estudiantil propuestas en cada uno de estos niveles (Tablas complementarias S1 a S3). Dentro de estas tablas, las actividades de aprendizaje propuestas para los estudiantes se basan en los luminoscopios de diferentes maneras. Por ejemplo, algunas actividades utilizan fluorescencia mientras que otras utilizan visualización no fluorescente. El uso inicial de luminoscopios sin fluorescencia puede preparar mejor a los usuarios para el uso posterior de fluorescencia, que es más desafiante desde el punto de vista técnico. Muchas actividades proponen el uso de embriones de pez cebra, pero se pueden utilizar otros organismos, ya sean recolectados localmente o comprados a proveedores biológicos. Si se desea utilizar embriones de pez cebra, los educadores deben conocer www.zfin.org como un medio para buscar laboratorios de investigación cercanos que ya utilicen pez cebra en su área, lo que puede brindar una oportunidad de acceso local para obtener embriones o adultos domésticos.

A continuación, realizamos una serie de experimentos piloto para proporcionar ejemplos representativos de actividades de aprendizaje estudiantil compatibles con NGSS para educación o extensión STEM. En el primer grado, NGSS recomienda que los educadores involucren a los estudiantes en la realización de observaciones, así como en el dominio apropiado para el grado en el análisis e interpretación de datos. Primero nos centramos en las ideas centrales específicas que abordan cómo los hijos de los mismos padres pueden variar en apariencia y los tipos de comportamientos que ayudan a los hijos a sobrevivir (Figura complementaria S3). En estos ejemplos, los estudiantes usan luminoscopios no fluorescentes para ver animales en la pantalla de un teléfono inteligente o tableta y desarrollan tablas para registrar sus observaciones. Para abordar cómo los comportamientos de la descendencia los ayudan a sobrevivir, utilizamos un lápiz para tocar suavemente los embriones, observar su respuesta y construir tablas para las observaciones y las partes del cuerpo involucradas en estas respuestas observadas. Aunque se muestra para renacuajos y orugas monarca (Figura complementaria S3), esta actividad sería compatible con el pez cebra o muchos insectos o gusanos recolectados localmente. Los profesores deben utilizar su discreción para determinar si la destreza manual está lo suficientemente desarrollada como para que los estudiantes puedan evitar causar daños innecesarios a las muestras.

Una pregunta adicional abordada en las ideas centrales del Grado 1 es cómo los animales capturan la información necesaria para el crecimiento y responden de una manera que les ayude a sobrevivir (Fig. 7a). El pez cebra primero obtiene la capacidad de observar visualmente los alimentos, rastrear y golpear los alimentos en movimiento (presas) y usar su mandíbula para comer alimentos durante su primera semana de vida19,20. Los paramecios son una fuente de alimento de uso común para los peces cebra jóvenes. Estos organismos unicelulares "nadan" en el agua utilizando cilios para impulsar sus movimientos. Los individuos pueden medir hasta 0,5 mm de largo y son difíciles de ver a simple vista, pero sus movimientos en placas de Petri que contienen larvas de pez cebra se observaron fácilmente usando un teléfono inteligente con lente de clip (Fig. 7b). La adición de paramecios a la placa de Petri que contenía pez cebra aumentó la frecuencia de los eventos de natación (Fig. 7c-e). Proponemos que los estudiantes comparen placas de Petri no alimentadas con las alimentadas (que contienen paramecia) y observen los tipos de comportamientos y partes del cuerpo utilizadas para responder a la presencia de paramecia (Fig. 7f). Estas respuestas son esenciales para el crecimiento y la supervivencia e involucran múltiples sistemas orgánicos.

Actividad de aprendizaje para estudiantes de primer grado que aborda las ideas centrales de NGSS sobre las partes del cuerpo animal necesarias para la supervivencia. (a) Descripción del estándar NGSS y actividad estudiantil propuesta. (b) El curso del tiempo (izquierda, serie de imágenes grises) muestra dos paramecios móviles (flechas azules y negras) en el mismo campo de visión que una larva de pez cebra paralizada (que se muestra para comparar escalas). La imagen en color de la derecha es una proyección temporal de máxima intensidad, que traza el píxel más brillante de cada fotograma en un vídeo timelapse y marca así la trayectoria de cada paramecio (verde). Se agregó color a esta imagen usando la función de texturizador en PowerPoint. (c) Esquema de la actividad de aprendizaje de los estudiantes que compara el comportamiento de natación y seguimiento de presas entre un plato que contiene larvas de pez cebra sin alimento (paramecio) versus hermanos en presencia de paramecios. (d) La serie de imágenes en el transcurso del tiempo muestra larvas de pez cebra en ausencia o presencia de paramecios en la placa de Petri. Tenga en cuenta la relativa falta de movimiento en los controles (superior, plato 1) en comparación con el plato tratado con paramecia (inferior, plato 2). El curso de tiempo que se muestra en (d) representa 33 ms. (e) El gráfico muestra la diferencia en la frecuencia del comportamiento de nado de las larvas de peces (5 dpf) entre los grupos propuestos en (d). N = 4 larvas por condición obtenidas en un experimento independiente; las barras muestran la media ± error estándar; P = 0,0911, prueba t de dos colas pareada. (f) Ejemplo de observaciones de estudiantes que comparan grupos del panel (d) y proponen las partes del cuerpo involucradas en los comportamientos de seguimiento de presas. Las imágenes se adquirieron utilizando un Apple iPhone 12 Pro con (b) y sin (d) lente macro con clip.

En ciencias biológicas de la escuela secundaria (grados 9 a 12), las ideas centrales de NGSS se centran en los genes, los mecanismos de herencia y el efecto de los genes y el medio ambiente en la manifestación de rasgos. Para abordar la influencia del medio ambiente en la visualización de rasgos, desarrollamos una forma de utilizar luminoscopios para monitorear los cambios inducidos por la temperatura y la acidez del agua. En estas actividades de aprendizaje, los estudiantes pueden investigar cómo los peces cebra individuales muestran cambios en la frecuencia cardíaca embrionaria en respuesta a estos estímulos ambientales (Figura complementaria S4). Demostramos actividades simples que comparan la frecuencia cardíaca antes y después de ser colocado sobre una almohadilla para reptiles a 35 °C durante 10 minutos (Figura complementaria S4). Los peces también pueden experimentar cambios en su entorno en forma de acidez del agua. Para modelar esto, agregamos vinagre doméstico al agua y observamos una disminución de la frecuencia cardíaca después de una inmersión de 25 minutos en agua ácida (Figura complementaria S4).

Además de observar los rasgos y su dependencia de la genética y el medio ambiente, las ideas centrales de la NGSS también enfatizan los mecanismos de herencia genética en el nivel de la escuela secundaria (Fig. 8a). Debido a que los transgenes son rasgos dominantes y se heredan en patrones mendelianos, el uso de los 'rasgos luminosos' del pez cebra puede ser una forma divertida y útil para que los estudiantes aprendan los cuadrados de Punnett. En esta actividad de aprendizaje, los estudiantes reciben varias placas de Petri, cada una de las cuales contiene embriones de diferentes cruces parentales (Fig. 8b). Primero, los estudiantes observan cada plato y la proporción de descendientes que muestran el "rasgo luminoso". Luego, los estudiantes desarrollan cuadrados de Punnett para todos los genotipos parentales posibles, resaltan qué genotipos de la descendencia mostrarán fenotipos dominantes y luego relacionan los datos observados con uno o más cuadrados de Punnett. Luego, los estudiantes pueden usar sus modelos para evaluar y discutir los posibles genotipos parentales para cada plato de descendencia.

La actividad de aprendizaje de los estudiantes de NGSS de los grados 9 a 12 se centró en la genética y la herencia. (a) Descripción del estándar NGSS y actividad estudiantil propuesta. (b) Imágenes representativas de fluorescencia con luminoscopio de larvas de pez cebra Tg (myl7: EGFP) de 4 dpf utilizadas para determinar la proporción que hereda el rasgo de corazón verde (indicado por flechas blancas). Los datos tabulados, cada conjunto obtenido de una única nidada de embriones de pez cebra, se comparan con cuadrados de Punnett que son consistentes con las proporciones fenotípicas de las crías observadas. Las imágenes se adquirieron utilizando un Apple iPhone 12 Pro.

En este estudio desarrollamos y caracterizamos componentes para convertir un teléfono inteligente o una tableta en un microscopio de fluorescencia de bajo grado por un costo de $50 (dólares estadounidenses) o menos por unidad. Estos dispositivos de construcción propia, a los que nos referimos como luminoscopios, son capaces de obtener imágenes de fluoróforos verdes y rojos con una resolución de hasta 10 µm y aprovechan las capacidades de alta velocidad de cuadros de las cámaras de los teléfonos inteligentes para grabaciones de video. El principal avance de este estudio es el desarrollo de la visualización de fluorescencia verde y roja utilizando linternas LED recreativas de bajo costo y filtros de iluminación de escenarios de teatro, que deberían ser compatibles con diseños de microscopios distintos del teléfono inteligente y la lente con clip que usamos en nuestro estudio. Debido al bajo costo, el diseño específico que caracterizamos e informamos en este estudio debería permitir equipar aulas enteras con múltiples luminoscopios, aumentando así la cantidad de tiempo que los estudiantes pueden trabajar de forma práctica con experimentos. Además, imaginamos que los luminoscopios podrían ser útiles para algunas aplicaciones de investigación que no requieren un gran aumento y tienen muestras fluorescentes brillantes. Por ejemplo, esto puede permitir a los laboratorios adquirir simultáneamente datos de vídeo de muchos microscopios luminosos al mismo tiempo, lo que puede no ser posible para laboratorios que no tienen acceso a varios microscopios de fluorescencia.

Si se usa en combinación con otros microscopios de teléfonos inteligentes de bajo costo o de bricolaje, como Foldscopes, los laboratorios o los estudiantes en las aulas pueden realizar una variedad de imágenes microscópicas con tabletas y teléfonos inteligentes. Específicamente, los Foldscopes pueden lograr un aumento al menos cinco veces mayor (superando los 2 µm de resolución) que la configuración del telescopio luminoso que probamos, lo que convierte a los Foldscopes en dispositivos potentes para imágenes no fluorescentes de teléfonos inteligentes2. Esta resolución adicional viene con compensaciones que pueden complementarse con luminoscopios. Además de las diferencias en la capacidad de fluorescencia, el aumento adicional del Foldscope tiene la contrapartida de distancias de trabajo reducidas, lo que puede hacer que sea difícil o imposible trabajar con organismos acuáticos o muestras en placas de Petri. En comparación, la lente con clip del telescopio luminoso que utilizamos en este estudio tiene distancias focales más largas y flexibles que la hacen compatible con muestras grandes y el uso de placas de Petri, y puede usarse para visualización no fluorescente con o sin el clip. lente macro. Si se utiliza sin la lente con clip, la distancia focal entre el teléfono inteligente y la muestra es del orden de 5 a 10 cm. De este modo, el marco del luminoscopio con la cámara del teléfono inteligente puede servir como microscopio de disección básico.

El resplandor es ahora una de varias formas de realizar microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio de teléfono inteligente. Los diferentes métodos y accesorios para lograr la visualización de fluorescencia con un teléfono inteligente tienen cada uno sus propias ventajas y desventajas dependiendo de la aplicación deseada por el usuario. Por ejemplo, existen opciones si la muestra es compatible con un portaobjetos, que se puede insertar en un aparato impreso en 3D que se conecta al teléfono inteligente21,22,23. Estos enfoques pueden ofrecer mayor aumento y resolución que la lente macro con clip utilizada por los luminoscopios. Un inconveniente es que es posible que los archivos adjuntos impresos en 3D solo funcionen con ciertos modelos de teléfonos inteligentes. La restricción de insertar portaobjetos también limita la distancia de trabajo, la capacidad de disección y la compatibilidad con especímenes como renacuajos vivos o embriones de pez cebra que deben sumergirse en agua. Otro método más consiste en cambiar permanentemente la lente del teléfono conectando los filtros directamente a la lente24. Este enfoque puede funcionar en un entorno de investigación donde se puede dedicar un teléfono inteligente para este propósito, pero no es una buena opción si los dispositivos propiedad de la escuela o del estudiante se usan para otros fines y no se pueden modificar permanentemente.

Nuestras pruebas en este estudio se realizaron utilizando embriones y larvas de pez cebra, pero el microscopio del teléfono inteligente no solo es compatible con el pez cebra. Sin embargo, si se desea utilizar un luminoscopio en entornos de educación K-12 o de pregrado, los acuarios y grupos de investigación de pez cebra se han vuelto comunes en la mayoría de los colegios y universidades y se pueden ubicar utilizando el sitio web de ZFIN para buscar miembros de la comunidad (personas) por ubicación (dirección; Nombre de la ciudad). Esto hace posible la adquisición de embriones de pez cebra en la mayoría de las ciudades importantes. Ya existen muchos programas de extensión STEM que brindan pez cebra a educadores locales y, en algunos casos, los capacitan25,26,27. Además, con instrucción y equipo mínimos, los educadores podrían comprar GloFish adultos en minoristas locales o en línea, realizar crías de peces en tanques pequeños y adquirir sus propios embriones con la frecuencia que deseen. Existen muchas líneas reporteras transgénicas que expresan fluoróforos rojos y verdes en diversos tipos de células y tejidos y se pueden obtener a través de centros de recursos o contactando directamente a los laboratorios. Según nuestras observaciones, cualquier línea transgénica que exprese EGFP o fluoróforos rojos sería compatible con los luminoscopios. Sería ventajoso seleccionar aquellos con una expresión indicadora fluorescente más brillante, una expresión más extendida (más células y tejidos) y con proteínas fluorescentes que coincidan más estrechamente con la longitud de onda del LED de la linterna. Por ejemplo, las linternas LED recreativas de ~ 450 nm y 530 nm que probamos funcionaron mejor con EGFP y DsRed, respectivamente.

Las recomendaciones de educación científica y la pedagogía basada en evidencia se han alejado del método tradicional de lectura y de la memorización de información por parte del alumno. En cambio, los estudios sobre enseñanza y aprendizaje indican que un aprendizaje más activo y basado en la investigación involucra a los estudiantes y respalda mejores resultados de aprendizaje28. Brindar a los estudiantes oportunidades para hacer sus propias observaciones, formar modelos y predicciones, adquirir e interpretar datos y utilizarlos para revisar sus modelos y su comprensión son conclusiones comunes de los estudios de educación en ciencias de la vida, así como de las recomendaciones de NGSS y Vision and Change in Under Graduate Biology Education15. ,29. El uso de dispositivos como Glowscopes y Foldscopes puede respaldar estos objetivos de permitir que los estudiantes aprendan sobre ciencias haciendo ciencia. De esta manera, los estudiantes desarrollarán su propia comprensión de los conceptos en lugar de intentar absorber la información entregada en formato de conferencia.

Nuestro estudio se basó principalmente en el pez cebra para las actividades de aprendizaje de educación científica. Los embriones o larvas de pez cebra transgénicos brillantes ofrecen a los estudiantes la oportunidad de explorar principios fundamentales como genes y proteínas, herencia, fisiología, comportamiento animal, ciclos de vida y desarrollo de organismos. Además, el pez cebra también puede ser una herramienta útil para abordar las interacciones entre organismos y el medio ambiente debido a la facilidad de agregar factores al agua del embrión en una placa de Petri. Por ejemplo, la estructura y función del corazón del pez cebra, que se puede observar fácilmente con el luminoscopio, está influenciada por herbicidas, pesticidas, fungicidas, alcohol y tabaco30,31,32,33,34. Estas y otras recomendaciones enumeradas en las Tablas complementarias S1 a S3 pueden proporcionar una base sobre cómo los educadores pueden usar los luminoscopios para entusiasmar a los estudiantes de todas las edades, hacer coincidir las actividades de aprendizaje con las ideas centrales disciplinarias de los NGSS y abordar las prácticas de ciencia e ingeniería de los NGSS. Vale la pena señalar que los luminoscopios o dispositivos similares podrían resultar útiles para actividades no biológicas como las geociencias, el arte, la óptica, la electrónica o la informática. Por ejemplo, se puede utilizar software como ij.imjoy.io en teléfonos móviles para controlar directamente la cámara, lo que añadiría una funcionalidad más avanzada y podría servir para enseñar a los estudiantes cómo trabajar con codificación básica y macros35.

Una posible limitación de la incorporación de luminoscopios en las aulas K-12 es la accesibilidad del dispositivo. Nuestras pruebas muestran que los luminoscopios son compatibles con dispositivos Apple, Samsung, Google y Motorola. En promedio, estos dispositivos representan aproximadamente el 95% de los utilizados en el mercado de Estados Unidos36,37,38. Aunque todavía no lo hemos probado con otros dispositivos como LG o Huawei, según la compatibilidad universal con los dispositivos que hemos probado, esperamos que funcionen de manera similar. Es posible que a los estudiantes en algunas aulas K-12 no se les permita usar dispositivos personales. Sin embargo, todos los distritos escolares con los que contactamos (N = 4) entregan iPads de Apple a los estudiantes o tienen flotas de dispositivos que pueden llevarse a las aulas para su uso cuando sea necesario. Una segunda limitación o desafío asociado con los luminoscopios es el abastecimiento constante de lentes y linternas LED azules. Los minoristas tradicionales generalmente no tienen LED azules o adaptadores de lentes para teléfonos inteligentes adecuados para esta aplicación, o solo los tienen de manera intermitente. Por lo tanto, compramos piezas a minoristas en línea, pero descubrimos que a menudo no se proporcionan números de piezas específicos y que la disponibilidad del producto puede cambiar con frecuencia. La información detallada de las piezas en los Métodos complementarios se puede utilizar para superar posibles problemas con el suministro de LED y lentes con clip. Una solución simple a esto podría ser la linterna LED multicolor (Lumenshooter) que usamos para ver la fluorescencia roja, que también funcionó bien para ver la fluorescencia verde cuando usamos su configuración de luz azul. Amazon ha seguido almacenando este producto durante todas nuestras fases de investigación y preparación del manuscrito. Es probable que una amplia gama de productos distintos de los que enumeramos en este estudio funcionen para esta aplicación, pero es posible que se necesiten algunas pruebas iniciales antes de ampliarla. Los LED azules o azul real (~ 450 nm) funcionan de manera más óptima para excitar los fluoróforos verdes que las luces violeta-azules desplazadas por los rayos UV (por ejemplo, 405 nm), que se venden más comúnmente en los minoristas tradicionales. Si un usuario tiene dificultades para determinar qué fuentes de luz son las más adecuadas y no es posible realizar pruebas prácticas con la muestra deseada, ponerse en contacto con el departamento de física de una universidad local debería ofrecer fácil acceso a un espectrómetro que pueda probar longitudes de onda con un mínimo de tiempo y esfuerzo.

Una limitación o inconveniente adicional implica el uso de LED azules, que podrían ser potencialmente peligrosos si los estudiantes dirigieran la luz hacia sus ojos de manera no deseada39. El faro LED azul utilizado en nuestros estudios mostró consumo de corriente e intensidades de luz en el rango identificado como "no representa un peligro debido a la respuesta de aversión a la luz brillante o malestar térmico" (RG-2), como se define en las directrices IEC 62471 sobre Seguridad fotobiológica de lámparas y sistemas de lámparas40. Este LED azul fue suficiente, pero no superado, para detectar fluorescencia verde en embriones. Por lo tanto, es probable que cualquier luz LED azul utilizada para la visualización de fluorescencia en teléfonos inteligentes deba utilizarse con cierta precaución. Una solución sería montar la luz LED en un soporte, lo que reduciría la exposición ocular accidental y no accidental y también estabilizaría la luz para una mejor recopilación de datos. Según nuestras conversaciones con varios profesores, administradores y especialistas en educación científica, las luces LED ya son habituales en las aulas de ciencias de primaria, incluidos los grados 3 y superiores. Los educadores deben ser conscientes de que las longitudes de onda azules pueden ser más dañinas que las linternas blancas o de otros colores, y que los punteros láser pueden representar un riesgo de seguridad aún mayor que las linternas. Instamos a los maestros a tener precaución y discreción al usar luces fluorescentes azules en las aulas de primaria. El uso no fluorescente de luminoscopios por parte de estudiantes en aulas de primaria temprana puede familiarizarlos con la microscopía de teléfonos inteligentes y prepararlos para un uso de fluorescencia más avanzado con los mismos dispositivos en niveles de grado posteriores. Esto coincidiría con una edad apropiada en la que los estudiantes sean conductualmente capaces de seguir las pautas de seguridad.

Todos los conjuntos de datos están disponibles previa solicitud del autor correspondiente.

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Agradecemos a Erika Vail (Winona State University) por su asistencia técnica, Carl Ferkinhoff (Winona State University), Andrew Ferstl (Winona State University) por sus consejos e intercambio de instrumentos, y a Amblynn Reisetter (Winona Public Schools) por sus útiles comentarios. Este trabajo fue apoyado por el premio NSF CAREER IOS-1845603 (JHH) y el premio de Proyectos Especiales de la Fundación Winona State University 251.0342 para Heather Nelson.

Departamento de Biología, Universidad Estatal de Winona, Winona, MN, EE. UU.

Madison A. Schaefer, Heather N. Nelson, John L. Butrum, James R. Gronseth y Jacob H. Hines

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JHH y HNN concibieron el proyecto. MAS, JHH, JLB y JRG realizaron experimentos. JHH y MAS escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Jacob H. Hines.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Schaefer, MA, Nelson, HN, Butrum, JL et al. Un microscopio de fluorescencia para teléfonos inteligentes de bajo costo para investigación, educación en ciencias biológicas y divulgación STEM. Informe científico 13, 2722 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29182-y

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Recibido: 26 de agosto de 2022

Aceptado: 31 de enero de 2023

Publicado: 09 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29182-y

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